1.3.1. Các nhóm vi khuẩn lactic khởi động
Giống khởi động cho sản xuất sản phẩm từ sữa là vi sinh vật đƣợc chủ động bổ sung vào nguyên liệu để tạo ra sản phẩm cuối cùng với các đặc điểm mong muốn, thông qua sự phát triển và quá trình lên men của chúng [47].
Trong cơng nghệ lên men các sản phẩm từ sữa, nhiệm vụ chính của giống khởi động vi sinh vật là : (1)- bảo quản sản phẩm về mặt sinh học, kéo dài thời hạn sử dụng so với nguyên liệu không lên men; (2)- tạo các đặc điểm cảm quan đặc trƣng nhƣ vị, hƣơng; (3)- tạo cấu trúc đặc trƣng cho sản phẩm về độ nhớt, độ cứng, độ thoáng... cũng nhƣ màu sắc; (4)- tạo lập các đặc điểm về dinh dƣỡng đặc trƣng. Giống khởi động trong sản xuất phomat có thể đƣợc chia thành các nhóm sau:
1.3.1.1. Các chủng vi khuẩn lactic ưa ấm
Trong công nghiệp sản xuất phomat, các chủng lactic ƣa ấm thƣờng đƣợc sử dụng nhiều hơn cả. Ngƣời ta ƣớc tính rằng hai phần ba q trình lên men sữa là sử dụng các chủng ƣa ấm. Đây dƣờng nhƣ là một đặc tính ƣu thế của các lồi
Lactococcus [19]. Nhóm LAB ƣa ấm có nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu ở 30°C, bao
gồm các loài thuộc hai chi Lactococcus và Leuconostoc. Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris đóng vai trị chính là sinh axit, các
loài Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc remoris tạo hƣơng thơm cho phomat [16].
Các giống khởi động ƣa ấm có thể đƣợc phân loại thành 4 nhóm sau, dựa trên khả tổng hợp các chất tạo hƣơng cho sản phẩm:
- Loại O: Gồm những chủng khởi động không tạo hƣơng: Lactococcus lactis ssp. lactis và Lactococcus lactis ssp. cremoris.
- Loại D: Gồm các chủng có khả năng lên men citrate – đóng vai trị tạo hƣơng: Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis.
- Loại B (hoặc L): Chỉ gồm các chủng Leuconostoc có khả năng lên men
citrate để tạo hƣơng.
- Loại BD (hoặc LD): Gồm cả các chủng có khả năng tạo chất thơm nhƣ Lc. lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis và các chủng thuộc chi Leuconostoc.
Sản xuất phomat có thể là nhờ chủng ƣa ấm đơn lẻ hoặc kết hợp các chủng với nhau. Trong hỗn hợp giống khởi động thì các chủng sinh axit thƣờng chiếm ƣu thế 90 – 99%, còn các chủng tham gia tạo hƣơng chỉ chiếm 1 – 10% [45].
1.3.1.2. Các chủng vi khuẩn lactic ưa nhiệt
Các chủng lactic ƣa nhiệt đƣợc sử dụng trong sản xuất các loại phomat cần nhiệt độ nấu cao: Emmental, Mozzarela. Các LAB ƣa nhiệt thuộc hai chi là
Lactobacillus và Streptococcus. Mặc dù Lactobacillus là một nhóm lớn gồm 64 lồi
nhƣng chỉ một vài trong số chúng có khả năng lên men sữa. Các lồi Lactobacillus đã đƣợc thƣơng mại hóa chủ yếu là: Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis và Lactobacillus helveticus. Ở chi Streptococcus, trong số 27 lồi thì chỉ có duy nhất Streptococcus thermophilus đƣợc
sử dụng làm giống khởi động trong sản xuất thực phẩm và các sản phẩm từ sữa. Nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu của các chủng ƣa nhiệt là từ 37oC – 42oC.
1.3.1.3. Các chủng khởi động “thủ công”
Giống khởi động “thủ công” (hay tự nhiên), bắt nguồn từ việc sử dụng một phần sản phẩm của mẻ lên men trƣớc để cấy sang mẻ mới. Một số loại phomat Ý và Thụy Sĩ, nƣớc sữa (whey) tách ra từ sữa đông của lô sản xuất trƣớc đƣợc ủ trong điều kiện chọn lọc nhƣ nhiệt độ cao và độ pH thấp để thu nhận whey “khởi động”. Thành phần hệ vi sinh vật của giống khởi động tự nhiên này là rất phức tạp, tƣơng đối biến đổi và thƣờng không xác định. Mặc dù hiệu suất không ổn định, trái ngƣợc với xu hƣớng hiện nay trong công nghệ tạo chủng khởi động (hiệu suất phải ổn
định), việc thay thế bằng những chủng khởi động xác định đơi khi tạo ra sản phẩm ít hƣơng thơm hơn [45].
Trong nhóm này, bên cạnh các chủng khởi động cố hữu cịn có các chủng thuộc chi Enterococcus thƣờng có mặt với số lƣợng lớn. Chúng có một số ƣu điểm: sản xuất ra axit nhanh, chịu đƣợc nhiệt độ đun sơi, có khả năng thích ứng nhanh với muối. Nhƣợc điểm chính là lồi này có nguồn gốc từ phân và một số chủng đƣợc coi là tác nhân gây bệnh. Theo Lopez-Diaz và cs. (2000) [40], enterococci đại diện cho các hệ vi sinh vật chiếm ƣu thế ở phomat truyền thống làm từ sữa chƣa qua thanh trùng nên đƣợc sử dụng nhƣ chủng khởi động. Enterococcus feacalis đã đƣợc sử dụng để thúc đẩy quá trình chín của phomat [45]. Ngồi ra, Enterococcus cịn
ảnh hƣởng có lợi đến sự sinh trƣởng của lồi LAB khác vì các hoạt động phân giải protein mạnh của chúng [40].
Pediococci không đƣợc sử dụng nhƣ là chủng khởi động trong bất kỳ sản
phẩm sữa nào mặc dù chúng có thể đƣợc tìm thấy trong các mẫu phomat đã ủ chín. Chỉ có hai lồi Pediococcus pentosaceus và Pediococcus acidilactici đƣợc tìm thấy trong các sản phẩm từ sữa. Gần đây, chủng pediococci có khả năng sử dụng lactose đã đƣợc sử dụng thay thế S. thermophilus vì các chủng thuộc lồi này dễ bị phage
xâm nhiễm [33].
1.3.2. Chức năng cần thiết của giống khởi động công nghiệp
Trong công nghiệp sản xuất phomat, điều quan trọng là tạo ra sản phẩm có chất lƣợng cao và ổn định. Điều này phụ thuộc chủ yếu vào giống khởi động sử dụng. Nhiều nghiên cứu về vai trị và những thuộc tính cần thiết của giống khởi động cho sản xuất phomat đã đƣợc thực hiện [19, 22, 39]. Giống khởi động trong sản xuất phomat cần có những đặc điểm: có khả n ăng đơng tụ nhanh , sinh axit, ảnh hƣởng tích cực đến sự hình hƣơng thơm, tổng hợp exopolysaccharide [16, 22].
1.3.2.1. Sản xuất axit
Sản xuất axit là đặc điểm phổ biến nhất của các chủng lactic khởi động. Chúng chuyển hóa lactose thành axit lactic, làm giảm pH của sữa. Sự axit hóa này khơng
phomat. Môi trƣờng pH thấp cũng ức chế đáng kể sự phát triển của các vi sinh vật gây hỏng sữa. Ngồi ra, sinh axit cịn ảnh hƣởng tích cực đến sự hình thành kết cấu, mùi và vị của phomat [49]. Các LAB lên men lactose lên men đồng hình (sản phẩm chính là axit lactic) và lên men dị hình (ngồi axit lactic cịn có các sản phẩm khác nhƣ ethanol, axit acetic, CO2).
1.3.2.2. Tổng hợp exopolysaccharide (EPS)
EPS là polysaccharide ngoại bào, có thể gắn chặt vào thành tế bào tạo thành lớp vỏ bao quanh tế bào vi khuẩn hoặc tồn tại dƣới dạng một chất nhờn lỏng (ropy polysaccharide) giải phóng vào mơi trƣờng. EPS có thể cấu tạo từ một loại monomer (homopolysaccharide) hoặc từ nhiều loại monomer khác nhau (heteropolysaccharide). Một số LAB nhƣ Lc. lactis ssp. lactis, Lb. delbrueckii
ssp. bulgaricus và S. thermophilus tổng hợp nên các heteropolysaccharides [16].
Trong mơi trƣờng tự nhiên, EPS có chức năng bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi các tác động của sự mất nƣớc, áp lực thẩm thấu, sự tấn công của thực khuẩn, chất kháng sinh, các chất độc hại và tăng khả năng bám dính vào bề mặt chất rắn [50]. Nhờ đặc tính tăng cƣờng độ nhớt, nhiều chủng khởi động sinh EPS đã đƣợc sử dụng trong sản xuất cơng nghiệp. Các chủng này đóng góp vào việc tạo nên cấu trúc mịn, chắc và ổn định của quện sữa.
1.3.2.3. Khả năng tạo hương
Khả năng tổng hợp cấu tử hƣơng của chủng khởi động sẽ ảnh hƣởng tới chất lƣợng của sản phẩm. Trong phomat, các hợp chất tạo hƣơng đƣợc chia thành hai nhóm: Các hợp chất hình thành trong giai đoạn lên men sữa và trong giai đoạn ủ chín. Nhóm đầu tiên bao gồm các axit hữu cơ: axit lactic và axit axetic đƣợc tổng hợp bởi Lc. lactis ssp. lactis và Lc. lactis ssp. cremoris và acetaldehyde, diacetyl, acetoin đƣợc Lc. lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis và các lồi Leuconostoc
chuyển hóa từ nguồn citrate có trong sữa. Nhóm thứ hai gồm các hợp chất hình thành từ quá trình phân giải protein và axit amin. Khả năng chuyển hóa axit amin thành các hợp chất thơm của LAB đã đƣợc nghiên cứu. Các loài Lc. lactis
subsp. lactis, Lc. lactis supsp. cremoris, Lb. helveticus, Lb. bulgaricus, Lb. casei
dimethyltrisulphide [57].
1.3.3. Kết hợp chủng vi khuẩn ƣa ấm và ƣa nhiệt trong sản xuất phomat
Trong công nghiệp sản xuất giống khởi động, nhiều chế phẩm kết hợp chủng lactic ƣa ấm và ƣa nhiệt để lên men sữa nhƣ: Feta Cheese Starter Culture gồm 2 chủng ƣa ấm: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris và 3 chủng ƣa nhiệt Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. helveticus; chế phẩm CHR HANSEN RST-643, Fresco® 3000, Fresco® 1000 gồm chủng thuộc loài S. thermophiphus kết hợp với chủng thuộc phân loài
Lactococcus lactis subsp. [64].
Nhiều nghiên cứu cho thấy sử dụng hỗn hợp chủng ƣa ấm và ƣa nhiệt đã đẩy nhanh q trình axit hóa so với chỉ dùng chủng ƣa ấm để lên men sữa và đơi khi, cải thiện đặc tính về hƣơng vị và cấu trúc của sản phẩm [14]. Theo Tison và cs., (1982) [53], Garrault (2006) [32], Oberg và Broadbent (1993) [44], Streptococcus thermophilus không phát triển đƣợc ở nhiệt độ lạnh 4oC, khi kết hợp với các chủng ƣa ấm, có thể trì hỗn sinh axit ở giai đoạn bảo quản và do đó làm tăng thời gian ổn định về chất lƣợng sản phẩm. Tuy nhiên, chủng ƣa nhiệt này không tạo nên hƣơng thơm đặc trƣng của phomat tƣơi vì khơng có khả năng chuyển hóa citrate thành diacetyl – một hợp chất hƣơng chính của phomat tƣơi [41]. Để hạn chế nhƣợc điểm này, có thể kết hợp các lồi ƣa ấm có khả năng chuyển hóa citrate với các lồi ƣa nhiệt [31].
1.3.4. Tình hình nghiên cứu tạo giống khởi động sản xuất phomat ở Việt Nam Nam
Hiện nay, nhiều nghiên cứu liên quan đến phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic cho lên men thực phẩm, axit lactic, probiotics đã đƣợc công bố: Nguyễn La Anh và cs., (2003) [3]; Nguyễn Thị Hồng Hà và cs. (2003) [6]; Nguyễn Hoài Hƣơng và cs. (2011) [7]; Nguyễn La Anh và cs. (2013) [1].
lactic dùng cho tôm chua.
Nghiên cứu về giống khởi động cho lên men sữa chƣa có nhiều cơng bố: Trần Thị Ngọc Mai (2010) [8] đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình cộng sinh giữa chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus spp. và nấm men Saccharomyces cerevisiae nhằm tạo ra hạt Kefir ổn định về chất lƣợng ứng dụng cho cho sản xuất
sữa chua. Hiện nay, hƣớng nghiên cứu tạo giống khởi động phục vụ cho sản xuất phomat chƣa có tài liệu nào đƣợc công bố.
CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguồn sữa và chủng vi sinh vật nghiên cứu
Nguồn sữa: Sữa đƣợc dùng để lên men là loại sữa tƣơi thanh trùng Mộc Châu
khơng đƣờng có hàm lƣợng (tính trên 100ml): Chất béo 3,5g ± 0,3; Protein 3,1g ± 0,1; Canxi 115mg ± 11.
Chủng vi sinh vật: 44 chủng vi khuẩn lactic ƣa ấm và ƣa nhiê ̣t thuô ̣c các chi
Lactococcus và Streptococcus đƣợc lƣu giữ tại Bộ Sƣu tập giống của Viện Công
nghiệp thực phẩm.
2.2. Hóa chất
Các hóa chất dùng để pha môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật: pepton, sodium acetate, triamonium citrate, Tween 80, MgSO4, MnSO4, K2HPO4, NaOH … xuất xứ Trung Quốc, cao nấm men, glucose, agar xuất xứ Việt Nam, và một số hóa chất khác.
Bộ kit kiểm tra khả năng sử dụng các nguồn cacbon, hoạt tính enzyme: API 50 CHL và API ZYM (Biomerieux – Pháp).
2.3. Thiết bị
Nồi hấp thanh trùng : Sturdy SA-300VF, Sturdy industrial, Nhật Bản.
Máy ly tâm : SORVALL RC 6, Đức.
Tủ cấy vô trùng : Bassaire, Anh.
Máy đo pH : Martini intrusments, Mauritius, EU
Bể ổn nhiệt : BF200, Yamoto, Nhật Bản.
Tủ sấy dụng cụ : Sanyo, Nhật Bản.
Tủ nuôi vi sinh vật : Sanyo, Nhật Bản. Một số thiết bị khác.
2.4. Môi trƣờng
Glucose 20 Pepton 10 Cao nấm men 15 MgSO4.7H2O 4ml MnSO4.H2O 5ml CH3COONa.3H2O 8.29 K2HPO4.3H2O 2.15 Tween 80 1 Triamonium citrate 2.62 pH : 6,5-6,8
Mơi trƣờng MRS – agar có bổ sung thêm agar 20g và 3g CaCO3 /lít.
Mơi trƣờng MRS – lactose, MRS – maltose, MRS – manlto dextrin thay thế nguồn đƣờng glucose bằng đƣờng lactose, maltose, maltose dextrin.
Môi trƣờng đƣợc hấp vô trùng 121oC trong 15 phút.
2.4.2. Môi trƣờng thử citrate Thành phần môi trƣờng M: Thành phần môi trƣờng M: Thành phần Hàm lƣợng (g/L) Sữa gầy 10g Peptone 2,5g Glucose 5g Agar 20g pH: 6,6
- Dung dịch A: Potasium ferry cyanide 10%.
- Dung dịch B: 1g ferric citrate + 1g sodium citrate trong 40ml nƣớc.
Hấp tiệt trùng môi trƣờng M, dung dịch A, B ở 115oC/ 15 phút. Sau khi hấp vô trùng, thêm 10 ml mỗi dung dịch A, B vào 1 lít mơi trƣờng M.
2.4.3. Mơi trƣờng thử hoạt tính protease ngoại bào
Thành phần môi trƣờng casein – agar:
Thành phần Hàm lƣợng (g/l)
Agar 20
Cân 8g casein pha trong 500ml nƣớc, gia nhiệt có khuấy nhẹ đến 80o
C, lọc bỏ cặn bằng giấy lọc. Định mức đến 1000ml, thêm 20g agar, đun sôi và tiệt trùng ở 121oC/15 phút. Khi nhiệt độ xuống đến 70-80oC, đổ ra đĩa petri, phơi khô và cất vào nơi quy định.
2.4.4. Môi trƣờng thử khả năng đông tụ sữa
Thành phần môi trƣờng litmus - lactose
Thành phần Hàm lƣợng/ lít
Sữa gầy 100g
litmus 70 ml
pH: 6,8
Cân 100g sữa gầy, pha trong 500 ml nƣớc ấm 37 - 40o
C. Bổ sung thêm 70ml litmus. Định mức tới 1 lít. Môi trƣờng đƣợc phân phối vào các ống nghiệm 10ml/ống. Hấp vô trùng 110oC/ 20 phút.
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.5.1. Phƣơng pháp vi sinh
Hoạt hóa giống: Giống có thể đƣợc hoạt hóa từ ống bảo quản đông khô, bảo quản lạnh sâu hay ống bảo quản trong thạch đứng sang ống nghiệm nút bông môi trƣờng MRS ở nhiệt độ 30oC/24 giờ.
Nhân giống: nhằm mục đích tăng số lƣợng mật độ tế bào vi sinh vật để bổ sung vào môi trƣờng lên men. Tại hoạt hóa lần 1, giống bảo quản ở lạnh sâu, đông khô đƣợc bổ sung vào 5 ml môi trƣờng MRS - glucose lỏng nuôi ở 30ºC, 18 – 20 giờ. Sau 20 giờ, lấy mẫu soi kính kiểm tra hình thái tế bào bằng kính hiển vi nhằm xác định có đúng chủng loại cần sử dụng, giống có bị tạp nhiễm hay khơng rồi mới tiếp tục nhân giống. Hoạt hóa lần 2, giống hoạt hóa lần 1 đƣợc bổ sung một lƣợng bằng 10% thể tích mơi trƣờng MRS – glucose lỏng nuôi ở 30ºC, 18 – 20 giờ. Giống hoạt hóa lần 2, có thể đƣợc bổ sung và nuôi cấy ở 30ºC, 18 – 20 giờ trong các bình tam giác mơi trƣờng MRS – glucose lỏng để đạt đƣợc lƣợng tế bào lớn đủ phục vụ cho quá trình lên men.
Lên men: Sau khi có giống đƣợc hoạt hóa trong bình tam giác, giống đƣợc xử lý và bổ sung vào môi trƣờng sữa. Điều kiện lên men: nhiệt độ 30ºC, đến thời gian đông tụ.
2.5.2. Phƣơng pháp bảo quản giống
Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền: Bảo quản giống bằng phƣơng pháp cấy truyền định kỳ sang các ống môi trƣờng MRS thạch đứng (hoặc đƣợc nêu cụ thể trong từng trƣờng hợp), nuôi trong 18 giờ ở 30oC, sau đó giữ trong tủ lạnh 3-5o
C. Cấy truyền đƣợc thực hiện mỗi tháng mội lần (hoặc đƣợc nêu cụ thể trong từng điều kiện).
Bảo quản bằng phương pháp lạnh sâu: Bảo quản giống trong môi trƣờng Glycerol
40%, giƣ̃ ta ̣i nhiê ̣t đô ̣ –80C
Bảo quản bằng phương pháp đông khô: Bảo quản trong môi trƣờng Liquid – drying
(g/l): sodium glutamate- 30, ribitol- 15; L-cystein hydrochloride monohydrate- 0,5 trong đệm potasium phosphate 1M
2.5.3. Xác định mật độ tế bào
2.5.3.1. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo độ đục
Mật độ vi sinh vật có thể xác định một cách gián tiếp thông qua đo độ đục. Khi một pha lỏng có chứa nhiều phân tử khơng tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trƣờng lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trƣờng cũng làm cho môi trƣờng trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập đƣợc quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục. Do vậy có thể