Chi
Kiểu lên men
Số lƣơ ̣ng chủng Lên men đồng hình Lên men di ̣ hình
Số lƣơ ̣ng Tỷ lệ (%) Số lƣơ ̣ng Tỷ lệ (%)
Lactococcus 34 100 0 0 34
Streptococcus 10 100 0 0 10
Các chủng vi khuẩn lactic này tiếp tu ̣c đƣợc khảo sát, sàng lọc theo các tiêu chí phù hợp làm giống khởi động nhƣ: khả năng làm đông tụ sữa nhanh, khả năng tạo EPS trong môi trƣờng sữa và khả năng lên men citrate.
3.1.1. Khả năng đông tụ sữa
Lên men đƣờng, tạo axit lactic là một trong những chức năng chính của các chủng khởi động sử dụng trong sản xuất phomat . Kết quả của quá trình axit hóa này là tạo ra quện sữa đông – là nguyên liệu cho sản xuất phomat . Kiểm tra khả nằn g đông tu ̣ sƣ̃a của 44 chủng vi khu ẩn lactic trên, sinh khối của mỗi chủng lấy tƣ̀ đĩa thạch nuôi cấy ở 30oC sau 48 giờ nuôi cấy đƣơ ̣c cấy vào ống nghiê ̣m chƣ́a môi trƣờng litmus – lactose.
Tƣ̀ kết quả đánh giá, 18 chủng có khả năng đơng tụ sữa nhanh (từ 6-10,5 giờ) đã đƣợc lƣ̣a cho ̣n ra để đánh giá các đă ̣c điểm tiếp theo về khả năng ta ̣o EPS trong môi trƣờng sƣ̃a và khả năng lên men citrate . Trong 18 chủng vi khuẩn lactic đƣợc lƣ̣a cho ̣n này có 11 chủng thuộ c chi Lactococcus ƣa ấm và 7 chủng thuộc chi
Streptococcus ƣa nhiệt. Danh sách các chủng vi khuẩn lên men lactic có khả năng làm đông tụ sữa nhanh đƣợc lựa chọn đƣợc thể hiện trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Danh sách các chủng vi khuẩn lactic làm đông sƣ̃a nhanh
Nhóm Ký hiệu chủng Thời gian đông tụ sữa
(giờ) Lactococcus ƣa ấm M11 8-10 M12 6 – 6,5 M21 6 – 6,5 M31 6 – 6,5 M32 6 – 6,5 M33 8-10 M34 6 – 6,5 VNC1 10 – 10,5 VNC2 10 – 10,5 VNC3 10 – 10,5 VNC53 8-10 Streptococcus ƣa nhiệt T11 5 – 5,5 T12 5 – 5,5 T14 5 – 5,5 T15 5 – 5,5 T21 5 – 5,5 T31 5 – 5,5 VNY3 6-7
Khảo sát khả năng tổng hợp EPS và lên men citrate trong môi trƣờng sƣ̃a của 18 chủng LAB đã đƣợc đánh giá. Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 3.3:
Bảng 3.3. Hàm lƣợng EPS đƣợc các chủng vi khuẩn lactic tổng hợp
Nhóm Ký hiệu chủng Nồng độ EPS (mg/l) Sự tăng EPS (mg/l) Khả năng lên men citrate Lactococcus ƣa ấm M11 111,52 52,51 + M12 109,67 50,66 + M21 114,11 55,10 + M31 117,13 58,12 + M32 124,6 65,59 + M33 118,43 59,42 + M34 121,13 62,12 + VNC1 129,47 70,46 + VNC2 127,01 68,00 + VNC3 126,42 67,41 + VNC53 101,82 42,81 + Streptococcus ƣa nhiệt T11 95,87 36,86 - T12 99,72 40,71 - T14 95,68 36,67 - T15 97,18 38,17 - T21 94,44 35,43 - T31 95,74 36,73 - VNY3 127,51 68,50 -
Đối chứng sữa không lên
men 59,01
Ký hiệu: (+) Có màu xanh Prussian – Sƣ̉ du ̣ng đƣơ ̣c citrate
(-) Không xuất hiện màu xanh – không sƣ̉ đƣợc citrate
Về khả năng tổng hợp EPS:
Kết quả cho thấy , hàm lƣợng nhìn chung các chủng vi khuẩn LAB thuộc nhóm ƣa nhiê ̣t chi Streptococcus làm tăng lƣợng EPS thấp hơn s o với nhóm LAB ƣa ấm chi Lactococcus ngoại trừ chủng Streptococcus VNY3 tạo ra 127,51 mg/l
EPS, làm tăng hàm lƣợng EPS hơn so với mẫu đối chứng là 68,50 mg/l.
Trong nhóm LAB ƣa ấm , hàm lƣợng EPS đƣợc tổng hợp tăng so với đối chƣ́ng dao đô ̣ng trong khoảng tƣ̀ 42,81 mg/l đến 70,46 mg/l. Trong đó chủng VNC1 tổng hơ ̣p hàm lƣợng EPS cao nhất , tăng 70,46 mg/l so với đối chƣ́ng , tiếp theo là
chủng VNC2 tăng 68 mg/l và chủng VNC53 tăng 67,42 mg/l. Chủng tổng hợp hàm lƣơ ̣ng EPS tăng thấp nhất trong nhóm LAB ƣa ấm là VNC53.
Trong nhóm LAB ƣa nhiê ̣t , hàm lƣợng EPS đƣợc tổng hợp tăng dao đô ̣ng so với đối chƣ́ng dao đô ̣ng tƣ̣ 35,43 mg/l đến 68,50 mg/l nhƣng chỉ trƣ̀ chủng VNY 3 làm tăng hàm lƣợng EPS cao còn lại 6 chủng ƣa nhiệt thuộc chi Streptococcus chỉ
làm tăng hàm lƣợng EPS xung quanh 35 đến 40mg/l.
Khả năng sinh tổng hợp EPS nhiều hay ít khơng tỉ lệ thuận với khả năng đông tu ̣ sƣ̃a . Các chủng Streptococcus T11, T12, T14, T21, T31, T15 đông tụ sƣ̃a nhanh nhất nhƣng ta ̣o ra ít EPS hơn so với các chủng khác . Ngƣợc la ̣i Lactococcus
VNC1, VNC2, VNC3 đông tụ sƣ̃a châ ̣m hơn nhƣng ta ̣o ra EPS khá cao . Chủng
Streptococcus VNY3 vƣ̀ a ta ̣o ra EPS nhiều vƣ̀a đông tu ̣ sƣ̃a nhanh . Tuy nhiên nồng đô ̣ EPS do các chủng lactic nghiên cƣ́u ta ̣o ra thấp hơn nhiều so với lƣợng EPS do các chủng vi khuẩn LAB phân lập từ sữa lên men Burkina Faso tổng hợp , trong đó chủng Streptococcus thermophiles MR10 có hoạt tính tổng hợp EPS cao (814 mg/l), thấp nhất là chủng Lactobacillus acidophilus MR1 (219 mg/l) (Savadogo và cs ., 2004) [50]. Tuy nhiên , kết quả nghiên cƣ́u của Frengova và cs ., (2002) [27] cho thấy các chủng Streptococcus thermophiles và Lactobacillus helveticus phân lập tƣ̀ hạt Kefir có khả tổng hợp EPS yếu , hàm lƣợng EPS yếu , hàm lƣợng EPS đƣợc các chủng này tổng hợp dao động tƣơng ứng trong khoảng 19,13 - 31,4 mg/l và 10,4- 22,63 mg/l.
Về khả năng lên men citrate:
Đánh giá khả nă ng lên men citrate của các chủng vi khuẩn lactic là cơ sở chọn đƣợc bộ chủng giống tạo hƣơng cho sản phẩm lên men . Kết quả cho thấy trong số các chủng vi khuẩn lactic đƣợc khảo sát , tất cả 11 chủng thuộc chi
Lactococcus đều có khả năng lên men citrate (Bảng 3.3). Tất cả 7 chủng
Streptococcus ƣa nhiê ̣t (T11, T12, T14, T15, T21, T31, VNY3) đều khơng có khả năng lên men citrate . Do đó viê ̣c kết hợp các chủng với nhau để làm giống khởi đô ̣ng lên men sƣ̃a là cần thiết. Các chủng sẽ bổ trợ cho nhau làm q trình đơng tụ
sƣ̃a nhanh, cấu trúc sản phẩm mi ̣n , có ảnh hƣởng tốt đến sự cảm quan . Mô ̣t số hình ảnh lên men citrate đƣợc thể hiện ở Hình 3.1.
Hình 3.1. Hình ảnh đánh giá khả năng lên men citrate của một số chủng vi khuẩn lactic
3.1.3. Khả năng tạo hƣơng thơm của các chủng LAB trên phomat tƣơi
Cảm quan hƣơng thơm của mẫu phomat tƣơi làm từ quện sữa đông tụ bởi 18 chủng đông tụ sữ a nhanh đƣơ ̣c đánh giá hƣơng thơm bằng phƣơng pháp đánh giá mùi. Các mẫu sữa lên men cùng ngày đƣợc đánh giá độc lập và viết nhận xét . Trong sớ các chủng Lactococcus có 2 chủng cho cảm quan tốt nhất khi đƣợc lên men sữa
làm phomat tƣơi là VNC 1 và VNC53. Trong số các chủng ƣa nhiê ̣t Streptococcus,
chủng VNY3 làm cho hƣơng vị tốt nhất trong số các chủng ƣa nhiệt . Kết quả đánh giá cảm quan hƣơng thơm đƣợc thể hiện chi tiết trong Bảng 3.4
Bảng 3.4. Cảm quan hƣơng thơm củ a các mẫu phomat
Nhóm Ký hiệu chủng Cảm quan
Lactococcus
ƣa ấm
M11 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. M12 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. M21 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. M31 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. M32 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. M33 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. M34 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. VNC1 Thơm, mùi bơ, sữa, chua dịu. VNC2 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. VNC3 Thơm, mùi bơ, sữa, mùi chua nhẹ. VNC53 Thơm, mùi bơ, sữa, chua dịu.
Streptococcus
ƣa nhiệt
T11 Thơm vừa, mùi sữa, thoảng mùi chua T12 Thơm vừa, mùi sữa, thoảng mùi chua
M12 T12 T14 M21 T21 T11 VNC2 VNC 1 VNC3 M33
Nhóm Ký hiệu chủng Cảm quan
T14 Thơm vừa, mùi sữa, thoảng mùi chua T15 Thơm vừa, mùi sữa, thoảng mùi chua T21 Thơm vừa, mùi sữa, thoảng mùi chua T31 Thơm vừa, mùi sữa, thoảng mùi chua VNY3 Thơm, mùi sữa, thoảng mùi chua
3.2. Tuyển chọn chủng giống, định tên và lập hồ sơ chủng giống
Trong hỗn hợp chủng giống khởi động, nhà sản xuất thƣờng phối trộn các chủng ƣa ấm và ƣa nhiệt nhằm mục đích: Tăng thời gian sử dụng sản phẩm, đẩy nhanh q trình đơng tụ sữa và hạn chế sự nhạy cảm của các thực khuẩn. Căn cứ vào các đặc điểm đã khảo sát, đề tài đã tuyển chọn ra hai chủng ƣa ấm Lactococcus
VNC1 và VNC53 cùng vớ i mô ̣t chủng ƣa nhiê ̣t Streptococcus VNY3 để lập hồ sơ
chủng giống.
3.2.1. Định danh chủng
Để định danh chủng, thực hiện tách ADN, đoạn gen mã hóa cho 16S rADN đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả từ hình cho thấy đã khuếch đại thành công đoạn gen 16S rDNA của 3 mẫu phân tích. Đoạn gen có kích thƣớc nhƣ mong đợi khoảng 1,4 kb (Hình 3.2).
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch và đƣợc giải trình tự đoạn gen 16S rADN. Kết quả đã thu đƣợc trình tự của từng chủng nhƣ trình bày trong phần phụ lục. Các trình tự này đã đƣợc sử dụng để tiến hành chạy Blastn trên ngân hàng dữ liệu Genbank NCBI, cho phép nhận diện loài trong mẫu nghiên cứu dựa vào độ tƣơng đồng trong cấu trúc trình tự 16S rADN.
Hình 3.2. Hình ảnh điện di Sản phẩm PCR đoạn gen 16S rADN của 3 chủng LAB Kết quả so sánh trình tự trên GenBank cho thấy: trình tự 16s rADN của VNC1 Kết quả so sánh trình tự trên GenBank cho thấy: trình tự 16s rADN của VNC1 có độ tƣơng đồng 100% với các trình tự có SĐK KT261215, KR265147, KT261212..., trình tự 16s rADN của VNC53 có độ tƣơng đồng 100% với các trình tự có SĐK AB68129, NR074949, KJ531389..., trình tự 16s rADN của VNY3 có độ tƣơng đồng 100% với các trình tự có SĐK HM058749, HM058894, FR725449...
Sử dụng các trình tự 16S rADN đã xác định đƣợc của các chủng nghiên cứu và các trình tự tƣơng đồng 100% với chúng trên GenBank, tiến hành căn trình tự và so sánh trình tự đa chuỗi sử dụng phần mềm ClustalX2 2.0. Sau đó xây dựng cây phát sinh lồi bằng phƣơng pháp Neighbour-Joining với trị số Bootstrap 100.
Từ kết quả phân tích cây phát sinh lồi (Hình 3.3) và so sánh tƣơng đồng trình tự 16S rADN, đề tài đã định danh đƣợc chủng VNC1 thuộc loài phụ
Lactococcus lactis subsp. lactis, chủng VNC53 thuộc loài phụ Lactococcus lactis subsp. cremoris và chủng VNY3 thuộc lồi Streptococcus thermophilus.
Hình 3.3. Cây phát sinh lồi của LAB dựa vào trình tự nucleotide 16S rADN. 3.2.2. Khả năng sử dụng các nguồn đƣờng
Phổ sử dụng các loại đƣờng của chủng khởi động là một đặc điểm cần đƣợc mơ tả. Điều này có ý nghĩa trong việc nghiên cứu kết hợp chủng để tạo hỗn hợp giống khởi động và công nghệ lên men tạo sinh khối của mỗi chủng. Do đó, tiến hành khảo sát khả năng sử dụng 49 loại đƣờng khác nhau theo bộ kit API 50CHL. Sinh khối của mỗi chủng thu từ đĩa thạch, đƣợc tái huyền phù trong ống Suspension Medium của bộ kit, để đạt đƣợc độ đục là 2 McFarland. Sau đó, dịch này đƣợc nhỏ vào các giếng trên bộ kit để kiểm tra khả năng sử dụng đƣờng. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.5:
Kết quả trên cho thấy, chủng VNC1, VNC53 có phổ sử dụng nguồn đƣờng rộng. Trong đó, sử dụng tốt các loại đƣờng galactose, glucose, fructose, mannose, N – Acetyl – Glucosamine, lactose, trehalose, gentiobiose. Trong khi đó, chủng VNY3 chỉ lên men đƣợc glucose và lactose. Chủng VNY3 sử dụng đƣợc lactose nhƣng
không sử dụng đƣợc galactose, do vậy, galactose giải phóng ra từ lactose đƣợc tích tụ trong mơi trƣờng. Trong khi đó, chủng VNC1 và VNC53 sử dụng tốt galactose. Khi kết hợp chủng ƣa ấm và ƣa nhiệt này để lên mem sữa thì sẽ khơng có sự cạnh tranh về dinh dƣỡng. Hơn nữa, sự kết hợp này còn tạo ra ƣu điểm là sử dụng triệt để các nguồn đƣờng, hạn chế sự phát triển của hệ vi sinh vật khơng đóng vai trị là giống khởi động.
Bảng 3.5. Khả năng sử dụng đƣờng của 3 chủng nghiên cứu
STT Đƣờng Chủng VNY3 VNC1 VNC53 24h 48h 24h 48h 24h 48h 0 Control - - - - - - 1 Glycerol - - - - - - 2 Erythritol - - - - - - 3 D- Arabinose - - - - - - 4 L- Arabinose - - - - - - 5 Ribose - - + + - - 6 D- Xylose - - (+/-) (+/-) - - 7 L- Xylose - - - - - - 8 Adonitol - - - - - - 9 β Methyl - D- Xyloside - - - - - - 10 Galactose - - + + + + 11 Glucose (+/-) + + + + + 12 Fructose - - + + + + 13 Mannose - - + + + + 14 Sorbose - - - - - - 15 Rhamnose - - - - - - 16 Dulcitol - - - - - - 17 Inositol - - - - - - 18 Mannitol - - - - (-/+) (-/+) 19 Sorbitol - - - - - - 20 α - Metyl -D-Mannoside - - - - - - 21 α - Metyl -D-Glucoside - - - - - - 22 N - Acetyl-Glucosamine - - + + + + 23 Amygdalin - - (+/-) (+/-) - - 24 Arbutin - - (+/-) (+/-) - -
STT Đƣờng Chủng VNY3 VNC1 VNC53 24h 48h 24h 48h 24h 48h 25 Esculin - - (+/-) + (-/+) + 26 Salicin - - + + - - 27 Cellobiose - - + + - (+/-) 28 Maltose - - + + - - 29 Lactose (+/-) + + + + + 30 Melibiose - - - - - - 31 Sucrose - - - - - - 32 Trehalose - - + + + + 33 Inulin - - - - - - 34 Melezitose - - - - - - 35 Raffinose - - - - - - 36 Starch - - (+/-) (+/-) - - 37 Glycogen - - - - - - 38 Xylitol - - - - - - 39 Gentiobiose - - + + (+/-) (+/-) 40 D- Turanose - - - - - - 41 D- Lyxose - - - - - - 42 D- tagatose - - - - - - 43 D- Fucose - - - - - - 44 L- Fucose - - - - - - 45 D-Arabitol - - - - - - 46 L- Arabitol - - - - - - 47 Gluconate - - - - - - 48 2-keto- Gluconate - - - - - - 49 5- keto- Gluconate - - - - - -
Ký hiệu: (+) lên men tốt – giếng có màu vàng; (+/-) lên men khá – giếng có màu hơi vàng; (- /+) lên men yếu – giếng chuyển màu; (-) không sử dụng – giếng giữ nguyên màu môi trường.
3.2.3. Phổ hoạt tính enzym
Tiến hành khảo sát hoạt tính của 19 enzym theo bộ kit API ZYM. Dịch enzym nội bào thu đƣợc sau khi phá tế bào, sinh khối thu từ đĩa thạch đã nuôi cấy 48 giờ ở nhiệt độ thích hợp và dịch enzym ngoại bào thu đƣợc từ dịch sữa đã lên men bởi các chủng trên đƣợc dùng để khảo sát phổ enzym. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.6:
Bảng 3.6. Phổ hoạt tính enzym của các chủng nghiên cứu STT Enzym STT Enzym Hoạt tính enzym (*) VNY3 VNC1 VNC53 Nội bào Sinh khối Nội bào Sinh khối
Nội bào Sinh khối 1 Đối chứng 0 0 0 0 0 0 2 Alkaline phosphatase 2 0 2 1 2,5 2 3 Esterase (C4) 0 2 2 1 2 1 4 Esterase lipase (C8) 1 0 1 1 1,5 2 5 Lipase (C14) 0 0 1 1 1 1 6 Leucine arylamidase 5 5 3 3 3 5 7 Valine arylamidase 2 1 1 1 1 1 8 Cystine arylamidase 0.5 0 1 1 1 1 9 Trypsin 0 0 1 1 1 0 10 α -chymotrypsin 3 1 1 1 1 0 11 Acid phosphatase 1 1 4 4 5 5 12 Naphthol - AS - BI - phosphohydrolase 1 1 1 1 1 2 13 α- galactosidase 0 0 1 1 0 0 14 β-galactosidase 5 1 1 1 0 1 15 β-glucuronidase 0 0 0 0 0 0 16 α - glucosidase 0 0 0 1 1 1 17 β-glucosidase 0 0 0 0 0 1 18 N-acetyl -β - glucosaminidase 0 0 1 0 1 0 19 α-mannosidase 0 0 0 1 0 0 20 α-fucosidase 0 0 0 1 1 1
(*) Ký hiệu: hoạt lực enzym định tính bằng màu sắc, chia theo thang điểm từ 0 – 5. Trong đó, 0: được xem là âm tính, 0,5 – 2: hoạt lực yếu, 3 – 5: hoạt lực mạnh.
Kết quả cho thấy, cả 3 chủng này đều không sinh tổng hợp enzyme β- glucuronidase. Theo các tác giả Bassyouni và cs. (2012) [15] và Ling và cs. (1994) [39] thì enzyme β-glucuronidase có liên quan tới bệnh ung thƣ do có thể giải phóng ra các chất độc hại đối với cơ thể và khơng đƣợc phép có ở những chủng đƣợc tuyển chọn là chủng probiotic.
Các enzyme phân giải lipit nhƣ esterase (C4), esterase lipase (C8) đều có ở 3 chủng nhƣng hoạt lực không mạnh. Hoạt lực của lipase (C14) chỉ có ở hai chủng ƣa
ấm và ở mức độ yếu. Hoạt lực của trypsin cũng chỉ thể hiện ở hai chủng ƣa ấm với mức độ yếu, ngƣợc lại, hoạt lực của α –chymotrypsin lại mạnh ở chủng ƣa nhiệt VNY3 và không đƣợc biểu hiện ở hai chủng ƣa ấm.
Hoạt lực của enzyme leucine arylamidase đều mạnh ở cả 3 chủng, ngƣợc lại hoạt lực của 2 enzyme valine arylamidase và cysteine arylamidase ở 3 chủng đều yếu. Đây là các aminopeptidase.
Cả 3 chủng đều biểu hiện hoạt tính axit phosphatase tuy nhiên hoạt tính ở hai chủng ƣa ấm mạnh còn chủng ƣa nhiệt yếu. Hoạt tính naphthol – AS – BI – phosphohydrolase và alkaline phosohatase yếu ở cả 3 chủng.
Hoạt tính β-galactosidase nội bào đều có ở 3 chủng nhƣng chủng VNY3 thể hiện hoạt tính mạnh trong khi hai chủng cịn lại thể hiện hoạt tính rất yếu. Điều này