Phƣơng pháp xác định độ axit

Hòa phần mẫu thử trong nƣớc, chuẩn độ điện thế bằng dung dịch NaOH 0,1 mol/l đến pH 8,3±0,01.

Tiến hành: Cân khoảng 10g mẫu thử đã đƣợc chuẩn bị, chính xác đến 0,01g, cho vào cốc loại 50ml, cho thêm khoảng 10ml và trộn.

Cho pH-met vào mẫu thử và để đầu điện cực đƣợc ngập trong mẫu. Chuẩn độ lƣợng chất bằng dung dịch NaOH cho tới pH 8,3± 0,01, trong cốc trong khi vẫn khuấy liên tục. Ghi lại thể tích NaOH đã dùng để chuẩn độ bằng ml, chính xác tới 0,05ml.

Tính độ acid chuẩn độ (w), bằng milimol trên 100g, theo cơng thức sau. w =

Trong đó:

V là thể tích dung dịch NaOH đã dùng để chuẩn độ (mililit); m là khối lƣợng của phần mẫu thử (gam);

Ghi kết quả đến hai chữ số thập phân.

2.5.12. Phƣơng pháp xác định trình tự tên lồi bằng giải trình tự 16S rDNA

Tách chiết DNA tổng số và PCR với mồi 16rS

DNA tổng số đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp đƣợc mô tả ngắn gọn nhƣ sau: Dịch nuôi đƣợc ly tâm ở 5000 x g, 10 phút, thu sinh khối, hòa tan sinh khối trong 0,5 ml đệm (Tris-HCl, EDTA, NaCl, SDS). Ủ phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Bổ sung 0,15 ml CH3COOK. Ly tâm 10000 x g trọng lƣợng tƣơng đƣơng isopropanol. Ly tâm ở 13 000 x g trong 10 phút ở 4oC thu tủa. Rửa tủa bằng EtOH 70%. Làm khơ tủa, hịa tan lại DNA với 50ul H2O PCR

Khuếch đại gen mã hóa 16S rRNA

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu đã đƣợc sử dụng quốc tế: 27F/1492R

Sử dụng cặp mồi 27F (5'- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG -3') và 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)

Thành phần phản ứng PCR :

+ 5 mM dNTPs (Fermentas) : 1,5 µl + 10X Taq Buffer (Sigma) : 2,5 µl

+ 5 µM 27F (mồi xi) : 1 µl

+5 µM 1492R (mồi ngƣợc) : 1µl

+ DNA template : 1 µl

+ Taq DNA pol (Sigma) : 0,5 µl

+ H2O : 17,5

Tổng thể tích phản ƣ́ng : 25 µl

Chƣơng trình nhiệt đƣợc thiết lập với pha biến tính ở 95C trong 5 phút, 35 chu kỳ nhiệt (95C trong 45 giây, 52C trong 1 phút và 72C trong 1 phút 30 giây). Quá trình khuyếch đại hoàn tất ở 72C trong 5 phút. Sản phẩm PCR đƣợc bảo quản ở 10C.

Sản phẩm PCR sau khi khuyếch đại đƣợc tinh chế bằng QIAEX II (Qiagen, Đức) theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Trình tự ADN đƣợc đọc bằng phƣơng pháp

“dideoxy chain termination” với các mồi 16S-27F và 16S-/1492R sử dụng máy đọc trình tự, model 377 của hãng Applied Biosystem. Các chuỗi ADN đƣợc so sánh với GeneBank bằng BLASTn trên NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).