CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU - HÓA CHẤT
Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu và hóa chất
STT Hóa chất Xuất xứ
1 Củ gừng tươi Lâm Đồng
2 Cần tây tươi Lâm Đồng
3 Rong nâu khơ Khánh Hịa
4 Bột gừng Jl. Alternatif Cibubur, Indonesia, số lô 0000254494 (tháng 4/2020)
5 Bột cần tây (hàm lượng 50% apigenin)
Salus Nutra Inc, China, số lô 191210 (tháng 12/2019).
6 Bột rong nâu (hàm lượng 80% fucoidan)
Công ty cổ phần Fucoidan Việt Nam, số lô 2018 (tháng 12/2018).
7 Apigenin analytical standard Sigma-Aldrich số lô BCCC0074, hàm lượng 99% apigenin
8 Shogaol analytical standard Sigma-Aldrich, số lô BCBZ1777, hàm lượng 90% [6]-shogaol
9 Fucoidan analytical standard Sigma Aldrich, số lô SLBZ7467, hàm lượng ≥ 95% fucoidan
10 Cồn công nghiệp Chemsol - Việt Nam 11 Hexane công nghiệp Chemsol - Việt Nam 12 Methanol công nghiệp Chemsol - Việt Nam
13 Ethanol, 99.8+%, for analysis,
absolute Fisher – Mỹ
14 Chloroform, 99.8+%, for
analysis, stabilized with amylene Fisher – Mỹ
15 Petroleum ether 40-60°C, for
analysis, n-hexane < 2% Fisher – Mỹ 16 Methanol, for analysis Fisher – Mỹ 17 Acetic acid 99,5% Trung Quốc 18 Acetonitrile analysis HPLC grade Fisher – Mỹ 19 Methanol analysis HPLC grade Fisher – Mỹ 20 Water analysis HPLC grade Fisher – Mỹ
21 Hydrochloric acid, 37%, for
analysis, d=1.18 Fisher – Mỹ 22 Acid phosphoric 85% Merck – Đức
23 Sulfuric acid, min 95%, for
analysis, d=1.83 Fisher – Mỹ 24 Silica gel (240-360 mesh) Ấn Độ
25 Silica gel 60 F254 cho TLC Merck – Đức 2.2. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ
Bảng 2.2. Danh mục thiết bị và dụng cụ
Thiết bị - Xuất xứ
Hệ thống cô quay chân không Eyela
CCA-1111, bộ gia nhiệt OSB-2100 Nhật Bản
Bể siêu âm Elmasonic S 80H Đức
Cân phân tích DV215CD/OHAUS Mỹ
Tủ sấy OF-12G/JEIO TECH Hàn Quốc
Hệ thống HPLC Flexar/ParkinElmer
đầu dò PDA Mỹ
Máy UV-VIS 1800 - Shimadzu Nhật Bản
Dụng cụ Bình cầu cổ nhám 250, 500, 1000 mL Cốc 100, 250, 1000 mL Ống mao quản Cột sắc ký Pipette kẻ 0,5 mL,1 mL, 2 mL, 5 mL Micropipette 100-1000 𝜇L, 10-100 𝜇L Ống đong 10 mL, 25 mL, 1 L Bình định mức Hệ thống bình lọc áp suất thấp (lọc nước cho HPLC)
Màng lọc dung mơi cellulose acetate 0,45 𝜇m × 70 mm
Phin lọc PTFE 0,45 𝜇m × 13 mm Cột sắc ký pha đảo … 2.3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Mẫu thực vật được dùng trong nghiên cứu là gừng (Zingiber officinale) (kí hiệu ZO110420) được thu hái tại huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng, cần tây (Apium
graveolens L.) (kí hiệu AG200720), được thu hái tại huyện Đức Trọng, tỉnh
Lâm Đồng, rong nâu (Sargassum mcclurei) (SM011219) được thu hái tại huyện Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa. Mẫu vật được định danh bởi TS. Nguyễn Ngọc Tuấn – Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm, trường ĐH Công nghiệp TP. Hồ Chí Minh và được lưu tại Trung tâm Thiết bị khoa học và phân tích Sinh Hóa Lý – Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng.
2.4. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Khảo sát điều kiện chiết tách
Q trình trích ly cao dược liệu chịu rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến lượng sản phẩm thu được như: loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi : nguyên liệu, thời gian, nhiệt độ và một số yếu tố khác. Có nhiều loại dung mơi như: diethyl ether, n-hexane, chloroform, acetone, ethanol, methanol… Tuy nhiên, với định hướng ứng dụng vào dược phẩm và thực phẩm chức năng, dung môi ethanol hoặc nước được chọn cho q trình trích ly ban đầu. Sau đó mới tiến hành sử dụng các loại dung mơi khác cho q trình tinh chế hợp chất. Sau khi chọn được dung mơi phù hợp, tiến hành thí nghiệm lựa chọn nồng độ dung mơi thích hợp ở các nồng độ khác nhau. Yếu tố ảnh hưởng tiếp theo trong nghiên cứu là lựa chọn tỷ lệ dung môi và nguyên liệu để cho lượng sản phẩm cao nhất, lựa chọn khảo sát các tỷ lệ dung môi : nguyên liệu là 1:1, 2:1, 3:1, 5:1, 10:1, 15:1, 20:1. Thời gian trích ly cũng ảnh hưởng rất lớn đến lượng cao chiết thu được. Thời gian trích ly: 1,2,3,5,8 giờ được lựa chọn khảo sát. Nhiệt độ trích ly cũng ảnh hưởng rất lớn đến lượng cao chiết. Do đó, ảnh hưởng của nhiệt độ đến q trình trích ly là: 30, 40, 50, 60, 70 và 80 ℃ được lựa chọn để nghiên cứu. Với khối lượng mỗi mẫu được khảo sát ban đầu là 100 g, sau khi tiến hành trích ly, lọc lấy dịch, cơ quay thu hồi dung môi, xác định lượng cao thô lớn nhất để lựa chọn yếu tố khảo sát ban đầu.
2.4.2. Chiết xuất, phân lập hợp chất
a) Chiết xuất, phân lập [6]-shogaol trong củ gừng
Chất chiết được trong dược liệu được tiến hành theo phương pháp chiết với ethanol 90%. Chất chiết được trong ethanol 90 % theo quy định khơng được ít hơn 6,0 % tính theo dược liệu khơ kiệt [4].
Định tính bằng phương pháp sắc kí lóp mỏng. Dung mơi khai triển: n- Hexane – Ethyl acetate - acid acetic băng (7,5 : 2,5 : 4 giọt). Dung dịch thử: Lấy 2 g bột dược liệu, thêm 5 mL ethyl acetate, lắc trong 3 phút, lọc, lấy dịch lọc làm dung dịch thử. Dung dịch đối chiếu: Lấy 2 g bột thân rễ Gừng (mẫu chuẩn) chiết nbư mô tả ở phần dung dịch thừ. Cách tiên hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µL mỗi dung dịch trên. Sau khi khai triển xong, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng. Phun thuốc thử vanilin – sulfuric. Sấy bản mỏng ở 110℃ cho đến khi hiện vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sẳc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Độ ẩm quy định không được vượt quá 13,0 % [4].
b) Chiết xuất, phân lập apigenin trong cần tây
Để chiết hợp chất apigenin trong cần tây, theo Dược điển Việt Nam V, lấy 5 g bột thô được chiết với 100 mL ether dầu hỏa (40-60℃) trong 2 giờ, lấy bã dược liệu để bay hết hơi ether, chiết tiếp như trên bằng 100 mL methanol trong 6 giờ, cất thu hồi dung môi. Độ ẩm không được quá 12,0 % [4]. Chất chiết được trong được liệu khơng được nhỏ hơn 7,0 % tính theo dược liệu khơ kiệt hoặc có thể tiến hành theo phương pháp chiết nóng dùng ethanol làm dung mơi. Để định tính bằng phương pháp TLC, dùng dung môi khai triển: Toluen - ethvl acetate - acid formic (4:4:0,5). Dung dịch thử: Lấy 3 g bột dược liệu, thêm 15 mL ethanol 96 %, đun sơi cách thủy 10 phút, lọc nóng, Bốc hơi dịch lọc cịn khoảng 2 mL, được dung dịch chấm sắc ký. Dung dịch chất đối chiếu: Hoà tan apigenin chuẩn trong methanol để thu được dung dịch có nồng độ 0,1 mg/mL. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 µL mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra đề khơ ở nhiệt độ phịng. Quan sát dưới ánh sáng từ ngoại ở bước sóng 254 nm vả 366 nm. Trên sắc ký đồ của dung
dịch thử phải có các vết cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của vết apigenin trên sắc kí đồ của dung dịch chất đối chiếu. Độ ẩm không quá 11,0 % đối với dược liệu khô [4].
c) Chiết xuất, phân lập fucoidan trong rong nâu
Rong nâu được thu hoạch vào mùa hạ và mùa thu, rửa bằng nước sạch 2 lần đến 3 lần để loại muối và tạp chất, cắt đoạn nhỏ, phơi hoặc sấy khô ừ 40- 50℃. Bảo quản nơi khô mát. Độ ẩm không được quá 15,0 % [4]. Bột rong nâu được chiết với ethanol 80% theo tỉ lệ 1:10 trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng và ở 70 ℃ trong 5h để loại mannitol và các chất ít phân cực, thu dung dịch, cô quay thu hồi cồn để tái sử dụng, thu được cao thô EtOH (độ ẩm 12,22%). Nguyên liệu được chiết với CaCl2 2% (ở 60℃) để phân lập hỗn hợp laminaran và fucoidan, khuấy hỗn hợp khoảng 45 phút tạo kết tủa. Dung dịch được chiết tiếp với nước ở 80 ℃ trong 5 giờ, thu được dịch chiết và phần cặn. Polysaccharide tan trong dung dịch được kết tủa bằng cách thêm ethanol 99 %, giữ ở nhiệt độ lạnh trong 2 giờ, ly tâm thu tủa (5500 vòng/phút), sấy tủa ở 70℃ trong 2 giờ. Thẩm tách loại muối và các tạp chất trọng lượng phân tử thấp bằng màng thẩm tách (12000 kDa) trong 48 giờ, đông khô thu phân đoạn fucoidan dạng bột.
2.4.3. Phương pháp định lượng bằng HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp tách các chất ra khỏi hỗn hợp phân tích trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh là chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được liên kết hố học với các nhóm hữu cơ.
Xác định hàm lượng hoạt chất trong mẫu bằng phương pháp HPLC:
𝐻𝐿(%) = 𝐴𝑢 × 𝐶𝑠
𝐴𝑠 ×
𝑉1 × 𝑉3× 10−4
𝑉2× 𝑚
Trong đó:
𝐴𝑢: diện tích peak dung dịch mẫu thử
𝐶𝑠: nồng độ dung dịch chuẩn (𝜇g/mL)
𝑚: khối lượng cao (g)
𝑉1: thể tích pha lỗng cao lần một (mL)
𝑉2: thể tích dung dịch hút đem đi pha lỗng lần hai (𝜇L)
𝑉3: thể tích pha lỗng lần hai (𝜇L)
Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao được đo trên thiết bị HPLC Flexar/ParkinElmer đầu dò PDA tại viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.4.4. Phương pháp định lượng bằng UV-Vis
Phương pháp dựa vào hiệu ứng hấp thụ xảy ra khi phân tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ. Vùng bức xạ được sử dụng trong phương pháp này là vùng tử ngoại gần hay khả kiến ứng với bước sóng khoảng từ 200-800 nm. Phổ UV- Vis được đo trên thiết bị UV-1800 Shimadzu tại viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.4.5. Thẩm định phương pháp định lượng
Theo các quy định của USFDA, AOAC, USP, ICH…các thông số cần thẩm định ứng với định lượng bằng HPLC bao gồm:
▪ Tính tương thích hệ thống (System suitability determination)
Đánh giá tính thích hợp hệ thống được cấu thành bởi các yếu tố như máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành và mẫu thử. Chuẩn bị mẫu chuẩn theo quy trình. Nồng độ hoạt chất trong mẫu tương ứng với nồng độ giữa của đường chuẩn. Lượng mẫu thử đủ cho ít nhất 6 lần tiêm mẫu. Tiến hành sắc ký, ghi lại SKĐ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích peak trung bình và các thông số khác của peak (độ phân giải, hệ số kéo đuôi...). Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích peak phải ≤ 2,0%, hệ số bất đối xứng peak < 2.0 và số đĩa lý thuyết > 2000 nếu khơng có quy định khác.
▪ Độ đặc hiệu (Specificity)
Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử. Tiến hành sắc kí các loại mẫu trắng, mẫu chuẩn (nồng độ ở khoảng giữa của đường chuẩn) và mẫu thử (nồng độ tương đương mẫu chuẩn) theo quy trình phân tích. u cầu: Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện peak trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Sắc ký đồ mẫu thử cho peak có thời gian lưu tương tự với peak chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ mẫu thử nếu xuất hiện thêm các peak khác không phải peak chất cần phân tích, thì peak của chất cần phân tích phải tách hồn tồn khỏi peak tạp và đáp ứng các yêu cầu chung được quy định.
▪ Độ lặp lại
Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm ở khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại có thể được đánh giá trên kết quả của tối thiểu 6 lần định lượng ở nồng độ thử 100%. Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng hoạt chất có trong mẫu, RSD ≤ 2% nếu khơng có quy định riêng.
▪ Khoảng tuyến tính và đường chuẩn (Linearity and Calibration curve)
Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích. Cần ít nhất 6 điểm ở nồng độ khác nhau và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu và nồng độ. Có thể chuẩn bị các mẫu của dãy chuẩn bằng cách pha loãng từ một mẫu chuẩn với các hệ số pha loãng khác nhau hoặc từ các mẫu chuẩn với lượng cân chất chuẩn khác nhau. Vẽ đồ thị tương quan để xác định khoảng tuyến tính. Kết quả thử được đánh giá bằng phương pháp tính đường hồi quy dựa vào phương pháp bình
phương tối thiểu theo phương trình y = ax + b, hệ số tương quan tuyến tính (R) ≥ 0,999.
▪ Độ đúng (Accuracy)
Độ đúng mô tả độ gần tới giá trị thực của đại lượng đo được. Tiến hành bố trí thí nghiệm để xác định độ thu hồi đối với mẫu thêm chuẩn hoặc xác định độ chệch đối với mẫu chuẩn được chứng nhận. Thực hiện thông qua đánh giá độ thu hồi (recovery). Chuẩn bị 03 loại mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn vào các mẫu thử. Lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ 80, 100 và 120% so với mức nồng độ định lượng trong quy trình và nằm trong khoảng tuyến tính. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập. Độ đúng của phương pháp được xác định theo cơng thức:
Trong đó: R%: Độ thu hồi
Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử thêm chuẩn (ppm) Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (ppm)
Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ppm)
Yêu cầu: Độ đúng của phương pháp nằm trong khoảng 98,0% đến 102,0% và giá trị RSD ≤ 2,0%.
▪ Giới hạn phát hiện (Detection of Limit - LOD), giới hạn định lượng (Quantitation of Limit - LOQ)
Giới hạn phát hiện là lượng nhỏ nhất của chất phân tích có thể phát hiện được nhưng khơng nhất thiết có thể định lượng. Có thể xác định bằng công thức sau:
𝐿𝑂𝐷 =3,3 𝑎 % 100 % = + − c m c m C C C R
Giới hạn định lượng là lượng nhỏ nhất của chất phân có thể định lượng được. Giới hạn định lượng thường lớn hơn giới hạn phát hiện của phương pháp. Giá trị LOQ của phương pháp được xác định theo cơng thức sau:
𝐿𝑂𝑄 = 10
𝑎
Trong đó: là độ lệch chuẩn được tính dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu chuẩn a là độ dốc của đường chuẩn.
2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu - Tính giá trị trung bình: - Tính giá trị trung bình: 𝑋̅ = 1 𝑛∑ 𝑥𝑖 𝑛 𝑖=1 - Tính độ lệch chuẩn: 𝑆 = √ 1 (𝑛 − 1)∑(𝑥𝑖 − 𝑋̅)2 𝑖=1
- Tính độ lệch chuẩn tương đối:
𝑅𝑆𝐷 = 𝑆
𝑋̅× 100%
Trong đó:
𝑋̅: giá trị của hàm lượng hợp chất chính
xi: giá trị của hàm lượng hợp chất chính của mẫu thứ i
n: số thí nghiệm để tính giá trị trung bình về hàm lượng của hợp chất chính
S: độ lệch chuẩn
2.5. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, NÂNG HÀM LƯỢNG, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG [6]-SHOGAOL TRONG CỦ VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG [6]-SHOGAOL TRONG CỦ GỪNG
2.5.1. Chiết tách [6]-shogaol từ củ gừng
Gừng khô Zingiber officinale (1 kg) được chiết trong EtOH 90% ở 60 ° C trong 3 giờ dưới hỗ trợ sóng siêu âm. Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:5, cô quay thu hồi dung môi thu được cao EtOH thô (độ ẩm 17,3%). Cao thô được lắc phân bố lỏng – lỏng hệ ether dầu hỏa – EtOAc (1:1) trong 30 phút, lặp lại 3 lần, cô quay thu hồi dung môi được cao ether dầu hỏa – EtOAc. Từ cao chiết EtOAc, tiến hành sắc kí cột hệ n-hexane - EtOAc (50:1) đến EtOAc 100% được các cao phân đoạn. Chọn phân đoạn chứa vết [6]-shogaol (kiểm tra bằng TLC) sắc kí cột hệ ether dầu hỏa - EtOAc (10:1). Hợp chất thu được tiến hành làm rõ cấu trúc và xác định bằng cách so sánh với dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR trong các tài liệu tham khảo.
Kiểm tra vết bằng phương pháp TLC: Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck), dung môi khai triển: ether dầu hỏa - EtOAc (1,5:1). Sau khi khai triển, để khơ bản mỏng ở nhiệt độ phịng. Phun thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH.