Dung dịch chuẩn Nồng độ [6]- shogaol (µg/mL) Cách pha S0 (mL) Thể tích cần định mức (mL) 1 2 2 10 2 4 4 3 5 5 4 6 6 5 8 8
Lọc 6 mẫu qua màng lọc 0,22 μm. Tiến hành sắc ký 6 mẫu dung dịch chuẩn và lập đường biểu diễn tương quan giữa diện tích và nồng độ chuẩn để xác định phương trình hồi quy.
▪ Giới hạn phát hiện – Giới hạn định lượng
LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu đo, theo cơng thức sau:
a SD LOD = 3,3
Trong đó:
- SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu - a: độ dốc của đường chuẩn Tính giá trị LOQ theo cơng thức sau:
3.3
LOQ= LOD
▪ Độ đúng Cách tiến hành:
- Cân chính xác 0,5 mg mẫu [6]-shogaol hịa tan trong MeOH và định mức trong bình định mức 100 mL thu được dung dịch thô (dung dịch A) nồng độ lý thuyết 5 ppm.
- Cân chính xác lần lượt mẫu chuẩn 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg hịa tan trong bình định mức 10 mL bằng MeOH. Hút 1 mL lần lượt các dung dịch chuẩn có nồng độ 40 ppm, 50 ppm và 60 ppm, pha lỗng trong bình định mức 10 mL bằng dung dịch A, được các dung dịch với nồng độ của mẫu chuẩn thay đổi 80 %, 100 % và 120 % so với mẫu thử.
- Tiến hành phân tích ở mỗi nồng độ trên 3 lần liên tiếp tại cùng điều kiện sắc kí. Tính hàm lượng của mẫu thử thêm chuẩn ở từng nồng độ, % độ phục hồi (R%) ở từng nồng độ thêm vào, độ lệch chuẩn tương đối (% RSD). 2.6. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, NÂNG HÀM LƯỢNG, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG APIGENIN TRONG CẦN TÂY
2.6.1. Chiết tách apigenin từ cần tây
Cần tây khô (1,2 kg) được chiết với EtOH 80% trong 5 giờ với sóng siêu âm ở 40 ° C, tỷ lệ nguyên liệu và dung môi 1:10. Làm bay hơi dung môi dưới áp suất giảm (800 mmBar), thu được cao thơ EtOH (độ ẩm 4,53%). Phân tích HPLC xác định được hàm lượng apigenin có trong cao EtOH.
Nâng cao hàm lượng apigenin bằng cách rửa cao EtOH thô nhiều lần (3-4 lần) trong ethanol tuyệt đối từ 0-10 oC. Sau 2 lần rửa đầu tiên lọc bỏ tạp chất. Những lần rửa sau thu lấy dung dịch màu vàng nhạt đến khi mất màu dung dịch, thu được cao EtOH 2. Để phân lập apigenin có độ tinh khiết ≥ 95%, cao chiết EtOH 2 được thực hiện trên cột sắc ký với hệ dung môi n-hexane – EtOAc (100:1 – 1:1) thu được 7 phân đoạn. Phân đoạn 7 (9 g) tiếp tục thực hiện sắc kí cột hệ
n-hexane - EtOAc (2:1) thu được 6,72 g chất kết tinh dạng bột màu vàng nhạt.
Kiểm tra vết bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng: Dùng bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck), hệ dung môi khai triển n-hexane - EtOAc (1,5:1). Triển khai sắc
ký, lấy bản mỏng ra để khơ ở nhiệt độ phịng. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm để hiện vết được một vết tròn màu vàng khi soi dưới đèn UV. Hợp chất này được xác định cấu trúc và nhận danh bằng cách so sánh dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR với các tài liệu tham khảo
2.6.2. Định lượng apigenin bằng phương pháp HPLC-PDA
▪ Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử
- Dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm: Cân chính xác 10 mg mẫu apigenin chuẩn
vào bình định mức 10 mL, thêm dung môi MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều, siêu âm 30 phút và để yên trong 5 phút. Lọc qua màng lọc 0,22 µm.
- Mẫu thử 10 ppm: Cân chính xác 1 mg mẫu cao chứa apigenin vào bình định
mức 100 mL, thêm dung mơi MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều để yên trong 5 phút, siêu âm trong 15 phút. Lọc qua màng lọc 0,22 µm.
- Mẫu chuẩn 10 ppm: Từ chuẩn gốc 1000 ppm pha loãng xuống các nồng độ
500 ppm, 200 ppm, 100 ppm, 10 ppm bằng MeOH. Tất cả các mẫu đều được lọc qua màng lọc 0,22 µm.
Điều kiện sắc kí: Để định lượng apigenin trong cao cần tây, apigenin chuẩn
99% (Sigma-Aldrich, số lô BCCC0074), sử dụng cột pha đảo VDSpher PUR 100 C18 (250 ì 4,6 mm, 5 àm). Pha ng MeCN - dung dịch 0,1% CH3COOH (40:60); tốc độ dòng 1,0 mL/phút; bước sóng 335 nm; nhiệt độ cột 25℃; thể tích tiêm 20 μL. Tất cả các mẫu được lọc qua màng 0,22 𝜇m.
2.6.3. Thẩm định quy trình phân tích apigenin từ cần tây
▪ Khảo sát tính tương thích hệ thống
Cách tiến hành:
- Cân bằng cột sắc kí bằng pha động trong 30 phút. - Tiến hành sắc kí mẫu chuẩn 10,0 ppm, 6 lần liên tiếp
- Khảo sát thơng số: Diện tích peak, số đĩa lý thuyết N, hệ số bất đối xứng T.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị 3 mẫu dung dịch:
- Mẫu trắng: Chuẩn bị 10 mL dung môi MeOH. Lọc qua màng lọc 0,22 μm. - Mẫu thử 10 ppm.
- Mẫu chuẩn 10 ppm.
Sắc kí lần lượt 3 mẫu đã chuẩn bị tại cùng điều kiện sắc kí.
▪ Độ lặp lại
Cách tiến hành :
- Chuẩn bị mẫu thử nồng độ 10 ppm.
- Tiến hành định lượng mẫu 6 lần với điều kiện sắc ký đã được chọn. Kết quả đánh giá dựa trên độ lệch chuẩn tương đối % RSD của nồng độ.
▪ Khảo sát khoảng tuyến tính
Cách tiến hành: từ dung dịch chuẩn gốc S0 10 ppm, pha tiếp mẫu dung dịch
chuẩn ở các nồng độ từ 1 ppm đến 10 ppm: