Thể tích dung mơi (L)
Khối lượng cao rong nâu thô (g)
0,2 51,662 0,3 52,745 0,5 64,128 1 75,782 1,5 75,996 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 45 50 55 60 65 70 75 80
Khối lượng cao r
ong nâu thô (
g)
Thể tích dung mơi (L) Khối lượng cao rong nâu thơ
Hình 3.31. Ảnh hưởng thể tích dung mơi đến khả năng trích ly rong nâu.
3.3.2. Quy trình chiết xuất fucoidan từ rong nâu
a) Phân lập fucoidan
Khối lượng bột fucoidan thu được là 3g (3,0% so với khối lượng rong nguyên liệu).
▪ Cấu trúc hợp chất fucoidan
Phổ 1H-NMR được coi như một phương pháp đặc trưng để nhận biết fucoidan dựa vào tín hiệu metyl của fucose trong mạch polysaccharide ở vị trí C6. Thơng tin về đặc trưng cấu trúc của fucoidan có thể thu nhận thơng qua tín hiệu đặc trưng của gốc đường fucose và galactose. Theo phổ 1H-NMR có tín hiệu của H-6 (nhóm methyl) của vịng α-L-fucopyranose tại δ 1,239 ppm. Bên cạnh đó, các tín hiệu đặc trưng cho proton H-6 và H-1 của gốc β-D-galactose được xác nhận thơng qua các tín hiệu ở δ 5,381 và δ 3,757 ppm. Tín hiệu ở δ 3,757 là của H-2; δ 4,135 là của H-3; δ 4,610; δ 4,665; δ 4,724 là của H-5.
Hình 3.32. Cấu trúc hợp chất phân lập từ rong nâu.
b) Quy trình tách chiết cao rong nâu chứa fucoidan
Thuyết minh quy trình: Rong nâu (20 kg) sau khi thu về được rửa sạch, loại
bỏ phần hư, phơi dưới bóng râm đến khối lượng khơng đổi, xay nhỏ thu được 5 kg bột rong nâu khô. Chất chuẩn fucoidan (≥ 95%, số lô SLBZ7467) được cung cấp bởi Sigma Aldrich (Singapore), MeOH, ACN, nước cất đạt tiêu chuẩn dung môi HPLC được cung cấp từ Fisher Scientific Korea Ltd. Các hóa chất, dung mơi khác như EtOH, acid acetic, acid sulfuric, ether dầu hỏa... được cung cấp từ hãng Chemsol (Việt Nam).
5 kg bột rong nâu được chiết với EtOH 80% theo tỉ lệ 1:10 trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng và ở 70℃ trong 5h để loại mannitol và các chất ít phân cực, thu dung dịch, cô quay thu hồi cồn để tái sử dụng. Cao EtOH (độ ẩm 12,22%) được chiết với CaCl2 2% (ở 60℃) để phân lập hỗn hợp laminaran và fucoidan, khuấy hỗn hợp khoảng 45 phút tạo kết tủa. Dung dịch được chiết tiếp với 1 L nước ở 80 ℃ trong 5 giờ, thu được dịch chiết và phần cặn. Các polysaccharide tan trong dung dịch được kết tủa bằng cách thêm 0,5 L ethanol 99 %, giữ ở nhiệt độ lạnh trong 2 giờ, ly tâm thu tủa (5500 vòng/phút), sấy tủa ở 70℃ trong 2 giờ, thu được tủa (m = 265g). Thẩm tách loại muối và các tạp chất trọng lượng phân tử thấp bằng màng thẩm tách (12000 kDa) trong 48 giờ, đem đông khô để thu các phân đoạn fucoidan dạng bột. Khối lượng bột fucoidan thu được là 150 g, hàm lượng fucoidan được xác định là 86%.
Hình 3.33. Quy trình chiết xuất fucoidan từ rong nâu. Thẩm tách, 48h, đông khô Thẩm tách, 48h, đông khô HPLC Fucoidan hàm lượng 86% Cao EtOH (ẩm 12,22%) Dịch fucoidan
Tủa sau ly tâm
Sấy 70oC, 2h
Chiết 1L H2O, 80 oC, 5h
Cặn Cao H2O
Bột rong nâu khô (5 kg)
Chiết EtOH 80% (1:10), 2h, to phòng 5h, 70℃
Cô quay loại dung môi ở 60oC CaCl2 2%, 60oC, khuấy 45’, lọc
Tủa laminaran, alginate Mannitol, chất ít
phân cực
Dung dịch
Xác định cấu trúc (NMR)
Kết tủa bằng EtOH abs, ly tâm (5500v/p)
Dung dịch Tủa (m = 265 g)
3.3.3. Định lượng fucoidan bằng phương pháp HPLC