Dung dịch chuẩn Nồng độ apigenin (µg/mL) Cách pha S0 (mL) Thể tích cần định mức (mL) 1 1 1 10 2 2 2 3 4 4 4 6 6 5 8 8
Lọc 6 mẫu qua màng lọc 0,22 μm. Tiến hành sắc ký 6 mẫu dung dịch chuẩn và lập đường biểu diễn tương quan giữa diện tích và nồng độ chuẩn để xác định phương trình hồi quy.
▪ Giới hạn phát hiện – Giới hạn định lượng
LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu theo cơng thức:
a SD
LOD
= 3,3
Tính giá trị LOQ theo cơng thức sau:
3.3
LOQ= LOD
Trong đó:
- SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu - a: độ dốc của đường chuẩn
▪ Độ đúng
Cách tiến hành:
- Cân chính xác 0,5 mg mẫu apigenin hịa tan trong MeOH, định mức trong bình định mức 100 mL thu được dung dịch mẫu thơ (dung dịch A) có nồng độ lý thuyết 5 ppm.
- Cân chính xác lần lượt mẫu chuẩn 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg hịa tan trong bình định mức 10 mL bằng MeOH. Hút 1 mL lần lượt các dung dịch chuẩn có nồng độ 40 ppm, 50 ppm và 60 ppm, pha lỗng trong bình định mức 10 mL bằng dung dịch A, được các dung dịch với nồng độ của mẫu chuẩn thay đổi 80 %, 100 % và 120 % so với mẫu thử.
- Tiến hành phân tích ở mỗi nồng độ trên 3 lần liên tiếp tại cùng điều kiện sắc ký. Tính hàm lượng của mẫu thử thêm chuẩn ở từng nồng độ, % độ phục hồi (R%) ở từng nồng độ thêm vào, độ lệch chuẩn tương đối (% RSD). 2.7. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, NÂNG HÀM LƯỢNG, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FUCOIDAN TRONG RONG NÂU
2.7.1. Chiết xuất fucoidan từ rong nâu
Bột rong nâu được chiết với ethanol 80% theo tỉ lệ 1:10 trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng và ở 70℃ trong 5h để loại mannitol và các chất ít phân cực, thu dung dịch, cô quay thu hồi cồn để tái sử dụng, thu được cao thô EtOH (độ ẩm
12,22%). Nguyên liệu được chiết với CaCl2 2% (ở 60℃) để phân lập hỗn hợp laminaran và fucoidan, khuấy hỗn hợp khoảng 45 phút tạo kết tủa. Dung dịch được chiết tiếp với nước ở 80 ℃ trong 5 giờ, thu được dịch chiết và phần cặn. Polysaccharide tan trong dung dịch được kết tủa bằng cách thêm ethanol 99 %, giữ ở nhiệt độ lạnh trong 2 giờ, ly tâm thu tủa (5500 vòng/phút), sấy tủa ở 70 ℃ trong 2 giờ. Thẩm tách loại muối và các tạp chất trọng lượng phân tử thấp bằng màng thẩm tách (12000 kDa) trong 48 giờ, đông khô thu phân đoạn fucoidan dạng bột.
2.7.2. Định lượng fucoidan bằng phương pháp HPLC
Điều kiện sắc kí: Để định lượng fucoidan trong rong nâu, fucoidan (≥ 95%, số
lô SLBZ7467) cung cấp bởi Sigma Aldrich được sử dụng làm chất chuẩn. Sử dụng cột gel HPLC Shodex, OH pak, KB-804 (300 × 8 mm). Điều kiện sắc ký: pha động H2O 100%, tốc độ dòng 1,0 mL/phút; nhiệt độ cột T1 40℃ và T2 75 ℃; thể tích tiêm 20 μL. Tất cả các mẫu được lọc qua màng 0,22 𝜇m trước khi tiêm vào cột HPLC.
Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 20 mg fucoidan chuẩn vào bình định mức
10 mL, hịa tan và làm vừa đủ bằng H2O, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 µm.
Dung dịch thử: cân chính xác 20 mg mẫu fucoidan vào bình định mức 10 mL,
hịa tan và làm vừa đủ bằng H2O và lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 µm.
2.7.3. Định lượng fucoidan bằng phương pháp UV-Vis
- Bước sóng phân tích: 399,5 nm
- Dung dịch chuẩn gốc 500 ppm: Cân chính xác 5 mg mẫu fucoidan chuẩn
(số lơ SLBZ7467, hàm lượng ≥ 95% fucoidan, Sigma - Aldrich) vào bình định mức 10 mL, thêm nước cất vừa đủ đến vạch. Siêu âm 15 phút. Từ chuẩn gốc 500 ppm, pha loãng thành các nồng độ 200 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm. Lọc qua màng lọc 0,22 µm.
- Mẫu thử 50 ppm: Cân chính xác 2 mg mẫu thử fucoidan, cho vào bình định
mức 10 mL, thêm nước cất đến vạch. Lắc đều, siêu âm trong 15 phút. Từ mẫu thử 200 ppm, pha loãng thành 50 ppm. Lọc qua màng lọc 0,22 µm.
- Phương pháp sử dụng: Thêm 1 mL dung dịch fucoidan chuẩn ở các nồng
độ 200 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm vào các ống nghiệm. Làm lạnh các ống nghiệm ở 4oC trong 5 phút, thêm 4,5 mL H2SO4 (85%). Đậy nắp kín các ống nghiệm để tránh bốc hơi và đặt trong bồn nước sôi trong 10 phút. Làm nguội các ống nghiệm dưới vòi nước, thêm 0,3 mL acid cysteine hydrochloric 0,1% vào các ống nghiệm. Đặt các ống nghiệm trong bóng tối 2 giờ, quét bước sóng hấp thụ và đo độ hấp thụ trên thiết bị UV- Vis. Mẫu trắng và mẫu thử được chuẩn bị bằng phương pháp tương tự. Xác định hàm lượng fucoidan có trong mẫu bằng phương pháp UV-Vis ở bước sóng 399,5 nm theo đường chuẩn.
2.7.4. Thẩm định quy trình phân tích fucoidan từ rong nâu bằng UV-Vis Vis
▪ Tính tương thích hệ thống
Tiến hành đo dung dịch fucoidan chuẩn 50 ppm 6 lần, ghi lại độ hấp thu và phổ đồ.
▪ Độ đặc hiệu
Đo độ hấp thụ lần lượt 3 mẫu trắng, fucoidan chuẩn 50 ppm và fucoidan thử 50 ppm.
▪ Khoảng tuyến tính
Từ dung dịch chuẩn gốc nồng độ 500 ppm, pha 5 mẫu dung dịch chuẩn ở các nồng độ từ 10 ppm đến 500 ppm. Ghi lại độ hấp thu của các mẫu fucoidan chuẩn có nồng độ: 20 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 500 ppm. Mỗi nồng độ tiến hành đo theo điều kiện đã chọn ba lần, lấy kết quả trung bình. Lập đường biểu diễn tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ chuẩn để xác định phương trình hồi quy.
Cách tiến hành: từ dung dịch chuẩn gốc S0 500 ppm, pha mẫu dung dịch chuẩn
ở các nồng độ từ 20 ppm đến 500 ppm: