3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách Salbutamol, Metoprolol,
Ractopamin bằng phương pháp điện di mao quản CE-C4D
Việc khảo sát một số điều kiện tách các chất Salbutamol (Sal), Metoprolol (Met), Ractopamin (Rac) được thực hiện trên thiết bị điện di CE- C4D với cột mao quản có chiều dài 60 cm, đường kính trong 50µm. Mẫu được bơm vào mao quản bằng phương pháp thủy động lực học theo kiểu xiphông bằng cách nâng một đầu mao quản (đặt trong dung dịch mẫu) lên độ cao 10cm so với đầu mao quản còn lại và độ cao này được giữ nguyên trong tất cả các thí nghiệm.
3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của hệ đệm
Trong phương pháp điện di mao quản, pH, thành phần và nồng độ của dung dịch đệm điện di ảnh hưởng rất nhiều đến dòng điện di thẩm thấu (EOF) và quá trình di chuyển của các chất trong mao quản, từ đó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tách các chất trong q trình phân tích. Do đó, việc khảo sát và lựa chọn điều kiện tối ưu cho các thông số này là một cơng việc rất quan trọng. Ngồi ra, cịn cần phải khảo sát các yếu tố khác ảnh hưởng đến khả năng phân tách và/hoặc cường độ tín hiệu như thời gian bơm mẫu, thế tách và các chất cản trở khác.
a. Khảo sát pH của dung dịch đệm điện di
Cùng với thành phần của hệ đệm thì giá trị pH của hệ đệm cũng là yếu tố quyết định trực tiếp đến quá trình tách điện di. Khi giá trị pH thay đổi, độ điện di của các chất và tốc độ di chuyển của dòng EOF cũng thay đổi. Vì vậy cần phải chọn giá trị pH thích hợp và giữ khơng đổi trong suốt q trình điện di. Trên cơ sở tham khảo tài liệu [16, 30] cho thấy, trong khoảng giá trị pH từ 4,9 đến 5,5 thì các β- agonist tách khỏi nhau khá tốt. Dó đó, việc khảo sát được được thực hiện trong khoảng pH từ 4,5 đến 6,0. Các điều kiện dùng để thực hiện khảo sát như sau:
- Hỗn hợp mẫu chuẩn tương ứng với nồng độ của Salbutamol 60,0 ppm, Metoprolol 60,0 ppm và Ractopamin 60,0 ppm.
- Các giá trị pH khảo sát xung quanh giá trị pH = 4,9, cụ thể: pH = 4,5; pH = 5,5 và pH = 6,0. Giá trị pH được điều chỉnh bằng máy đo pH trên cơ sở giữ
nguyên nồng độ hợp phần bazơ (Arginin - Arg) là 10mM và thêm dần hợp phần axit (axit Axetic - Ace) vào cho đến khi đạt giá trị pH mong muốn.
- Thế điện di 18kV, chiều cao bơm mẫu 10cm, thời gian bơm mẫu 20s. Các kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH với bốn giá trị pH nằm trong khoảng từ 4,5 - 6,0 được nêu trong bảng 3.1, hình 3.1 và hình 3.2.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của Sal, Met và Rac
Chất phân tích Nồng độ (ppm) pH = 4,5 pH = 4,9 pH = 5,5 pH = 6,0 Spic (mV.s) tdc (phút) Spic (mV.s) tdc (phút) Spic (mV.s) tdc (phút) Spic (mV.s) tdc (phút) Sal 60,0 50,6 9,2 52,1 8,7 48,2 8,1 40,0 7,3 Met 60,0 45,9 9,3 42,9 8,9 37,8 8,2 28,3 7,8 Rac 60,0 47,1 10,0 49,1 9,2 45,5 8,4 36,0 8,1 600 500 400 300 200 100 0
Thêi gian di chun (s) pH=4,5
pH=4,9 pH=5,5 pH=6,0
50mV
Sal Met Rac
Hình 3.1 . Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến sự phân tách của Sal, Met, Rac
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến diện tích pic của Sal, Met, Rac
Trong phương pháp điện di mao quản, khi pH của dung dịch đệm thay đổi sẽ làm thay đổi điện tích, tốc độ của các chất, từ đó làm thay đổi thời gian di chuyển của các chất phân tích trong mao quản. Ngồi ra, cịn cần quan tâm đến giá trị pK của các chất phân tích vì nó ảnh hưởng trực tiếp đến mức độ phân ly của các nhóm chức trong phân tử chất đó ở các giá trị pH khác nhau. Các chất phân tích ở đây là Sal, Met và Rac đều có giá trị pK > 9. Trên cơ sở cơng thức cấu tạo của các chất phân tích có thể thấy, khi q trình điện di thực hiện ở pH lớn hơn giá trị pK sẽ làm cho chúng mang điện tích âm nhiều hơn và ngược lại, khi quá trình điện di thực hiện ở pH nhỏ hơn giá trị pK sẽ làm cho chúng mang điện tích dương nhiều hơn. Khoảng pH khảo sát từ 4,5 - 6,0 đều thấp hơn giá trị pK của các chất phân tích nên chúng đều mang điện tích dương.
Các kết quả khảo sát trong khoảng pH từ 4,5 - 6,0 cho thấy, khi pH tăng thì tổng thời gian phân tích giảm nhưng đồng thời diện tích pic và khả năng tách pic của các chất cũng giảm. Điều này rất phù hợp với những phân tích vừa nêu trên. Tuy nhiên, so sánh kết quả khảo sát thu được với hai giá trị pH = 4,5 và pH = 4,9 cho thấy: ở pH = 4,5 thì diện tích pic của Metoprolol tăng nhưng diện tích pic của Salbutamol và Ractopamin lại giảm, trong khi đó ở giá trị pH = 4,9 các chất được tách tốt nhất, pic gọn nhất và tín hiệu đường nền ổn định, thời gian phân tích hợp lý.
Do đó, pH = 4,9 được lựa chọn cho các bước khảo sát tiếp theo. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây của các tác giả khác [17].
b. Khảo sát thành phần của hệ đệm điện di
Cùng với pH, thành phần dung dịch đệm ảnh hưởng rất nhiều đến kết quả phân tích điện di. Việc khảo sát ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm được thực hiện bằng cách sử dụng hợp phần bazơ thông dụng trong phương pháp CE- C4D là Arginine (Arg) (pKa=9,09) hoặc Histidin (His) (pKa=8,97) kết hợp với một hợp phần axit như phosphoric (Phos), ascorbic (Asc) hoặc Axetic (Ace). Trong đó, hợp phần bazơ được giữ nguyên nồng độ 10mM và dùng hợp phần axit để điều chỉnh đến pH = 4,9.
Thực hiện q trình khảo sát phân tích điện di với các điều kiện sau:
-Hỗn hợp mẫu chuẩn tương ứng với nồng độ của Salbutamol 60,0 ppm, Metoprolol 60,0 ppm và Ractopamin 60,0 ppm trên 4 hệ đệm khác nhau: Arg/Phos, His/Ace, Arg/Asc và Arg/Ace.
- Thế điện di 18kV, chiều cao bơm mẫu 10cm, thời gian bơm mẫu 20s. Các kết quả khảo sát thành phần dung dịch đệm được thể hiện trong bảng 3.2, hình 3.3 và hình 3.4.
Bảng 3.2. Kết quả sự phụ thuộc diện tích pic của Sal, Met và Rac vào thành phần hệ đệm điện di Chất phân tích Nồng độ (ppm) Diện tích pic (mV.s) Đệm His/Ace Đệm Arg/Ace Đệm Arg/Asc Đệm Arg/Phos Salbutamol 60,0 34,2 53,8 35,0 26,9 Metoprolol 60,0 24,1 42,5 28,2 20,6 Ractopamin 60,0 29,1 50,1 31,0 23,8
600 500 400 300 200 100 0 Arg/Ace Arg/Asc His/Ace 50mV Sal Met Rac Arg/Phos
Hình 3.3. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần hệ đệm đến sự phân tách của Sal, Met, Rac
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic của Sal, Met, Rac vào thành phần hệ đệm điện di
Từ các kết quả khảo thu được cho thấy, hệ đệm sử dụng hợp phần axit là phosphoric và ascorbic cho đường nền không tốt bằng hệ đệm sử dụng axit axetic. Trong hai hệ đệm còn lại sử dụng axit axetic thì hệ đệm sử dụng histidin cho kết quả đường nền tốt hơn nhưng diện tích pic và độ phân giải giữa các pic khơng tốt
bằng hệ đệm sử dụng arginin, điều này có thể gây khó khăn khi hai pic liền kề có hàm lượng lớn hơn. Hệ đệm Arg/Ace cho kết quả độ phân giải giữa các pic tốt nhất, tín hiệu của các pic cao nhất, do đó hệ đệm này được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo.
c. Khảo sát nồng độ dung dịch đệm điện di
Sau khi chọn được pH và thành phần của dung dịch đệm, nồng độ của dung dịch đệm điện di cũng cần được khảo sát tối ưu. Trong phương pháp điện di mao quản, nồng độ đệm phải đủ lớn để tạo nên môi trường điện ly cho các ion di chuyển và không tạo ra các vùng dẫn điện khác nhau trong mao quản làm ảnh hưởng đến quá trình di chuyển này. Qua tham khảo tài liệu, nồng độ của các cấu tử trong dung dịch đệm điện di sử dụng trong phương pháp CE-C4D thường lớn hơn 10 mM. Do đó, việc khảo sát được tiến hành với các nồng độ từ 10mM trở lên, cụ thể là hệ đệm Arg/Ace pH = 4,9 có các nồng độ 10 mM, 15 mM, 20 mM. Các điều kiện khác bao gồm:
- Hỗn hợp mẫu chuẩn tương ứng với nồng độ của Salbutamol 60,0 ppm, Metoprolol 60,0 ppm và Ractopamin 60,0 ppm
- Thế điện di 18kV, thời gian bơm mẫu 20s, chiều cao bơm mẫu 10cm
Các kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm điện di được thể hiện trong bảng 3.3 và hình 3.5.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của Sal, Met và Rac vào nồng độ dung dịch đệm điện di
Chất phân tích Nồng độ (ppm) 10mM 15mM 20mM Spic (mV.s) tdc (phút) Spic (mV.s) tdc (phút) Spic (mV.s) tdc (phút) Sal 60,0 52,1 9,2 49,9 10,0 35,6 10,2 Met 60,0 42,9 9,3 37,6 10,1 29,0 10,4 Rac 60,0 49,1 10,0 46,4 10,5 33,1 10,8
800 600
400 200
Thêi gian di chun (s) 20mV
10 mM 20 mM 15 mM
Sal Met Rac
Hình 3.5. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm điện di đến quá trình phân tách các chất Sal, Met, Rac
Qua kết quả ở điện di đồ hình 3.5 và bảng 3.3 cho thấy: khi tăng nồng độ dung dịch đệm điện di thì thời gian di chuyển của cả 3 chất phân tích (Salbutamol, Metoprolol, Ractopamin) đều tăng nhưng tín hiệu (diện tích) pic lại giảm. Điều này được giải thích là do khi tăng nồng độ đệm thì độ điện di hiệu dụng của các ion dương và ion âm tăng, do đó làm tăng thời gian di chuyển của chất tan. Khi nồng độ đệm tăng cũng làm tăng độ dẫn điện của dung dịch điện ly nền, làm giảm tín hiệu của các chất phân tích.
Ngoài ra, trong ống mao quản, khi nồng độ đệm tăng, nghĩa là nồng độ của các ion tăng, thường làm thay đổi độ lớn của lớp điện kép, ảnh hưởng đến sự tương tác tĩnh điện của lớp điện kép với thành mao quản. Lớp điện kép này thường làm cho vùng mẫu di chuyển không phẳng và khả năng tách chất kém, như kết quả với nồng độ đệm điện di là 20mM. Ở nồng độ đệm 15mM cho hình dáng các pic khá cân đối và sắc nét, các chất được tách tương đối tốt, nhưng tín hiệu diện tích pic của các chất phân tích thu được nhỏ hơn và thời gian phân tích dài hơn so với nồng độ đệm 10mM. Do đó, chúng tơi lựa chọn đệm Arg/Ace có nồng độ 10mM là điều kiện tối ưu cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu
Trong quá trình nạp mẫu vào mao quản, lượng mẫu hay vùng mẫu nạp phải đủ lớn để đảm bảo đạt được độ nhạy tốt nhưng nếu vùng mẫu nạp vào quá lớn thì sự phân tán (mở rộng vùng mẫu) sẽ xuất hiện mạnh do hiện tượng khuếch tán làm giảm hiệu suất tách. Do đó, thời gian bơm mẫu hợp lý cũng cần được khảo sát để đảm bảo thu được tín hiệu lớn nhất mà pic không bị giãn rộng. Việc khảo sát thời gian bơm mẫu được thực hiện theo phương pháp thủy động lực học kiểu xiphông ở độ cao 10cm với 4 giá trị thời gian bơm mẫu khác nhau là 10s, 20s, 30s và 50s. Các điều kiện khảo sát khác như sau:
- Hỗn hợp mẫu chuẩn tương ứng với nồng độ của Salbutamol 60,0 ppm, Metoprolol 60,0 ppm và Ractopamin 60,0 ppm
- Dung dịch đệm điện di là Arg/Ace (10mM), pH=4,9 -Thế điện di 18kV, chiều cao bơm mẫu là 10 cm
Các kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu thể hiện trong bảng 3.4 và hình 3.6.
Bảng 3.4. Kết quả sự phụ thuộc diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của Sal, Met, Rac vào thời gian bơm mẫu
Chất phân tích Nồng độ (ppm) 10s 20s 30s 50s Spic (mV.s) tdc (phút) Spic (mV.s) tdc (phút) Spic (mV.s) tdc (phút) Spic (mV.s) tdc (phút) Sal 60,0 33,5 9,1 50,2 9,2 81,7 9,5 118,9 9,7 Met 60,0 29,2 9,3 41,1 9,3 65,3 9,7 83,2 10,0 Rac 60,0 31,6 9,4 48,2 9,5 78,0 9,9 107,3 10,1
800 700 600 500 400 300
Thêi gian di chuyÓn (s)
t = 20s t=30s
t=50s
50mV
Sal Met Rac
t = 10s
Hình 3.6. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu
Từ các kết quả khảo sát ở hình 3.6 và bảng 3.4 có thể nhận thấy, khi tăng thời gian bơm mẫu, thời gian di chuyển của các chất hầu như không thay đổi hoặc thay đổi rất ít nhưng diện tích pic tăng tương ứng khi tăng thời gian bơm mẫu từ 10s đến 50s. Điều này hồn tồn phù hợp vì khi tăng thời gian bơm mẫu sẽ làm tăng lượng mẫu được bơm vào mao quản, tạo tín hiệu lớn hơn. Tuy nhiên, khi thời gian bơm mẫu dài tạo tín hiệu lớn hơn sẽ làm dịch chuyển đôi chút về thời gian di chuyển của các chất cũng như làm giảm độ phân giải giữa các pic. Ngoài ra, qua khảo sát sơ bộ thời gian bơm mẫu trên đối tượng mẫu thực tế là thức ăn chăn ni thì ngồi sự xuất hiện của các chất phân tích cịn có các cation gây ảnh hưởng, nếu thời gian bơm mẫu dài sẽ tạo các tín hiệu lớn của các cation. Do đó, chúng tơi lựa chọn thời gian bơm mẫu 20s là điều kiện tối ưu trong nghiên cứu này để thực hiện các khảo sát tiếp theo.
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thế đặt vào hai đầu mao quản
Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có nguồn thế (E) một chiều nhất định đặt vào hai đầu mao quản, nó điều khiển và duy trì sự điện di của các chất. Để có kết quả tốt và ổn định thì cần phải chọn thế thích hợp nhất và giữ cho thế này luôn ổn định trong suốt quá trình phân tách. Trên cơ sở trang thiết bị sẵn có và tham khảo tài liệu, các điện thế được lựa chọn khảo sát là: 10 kV, 15 kV,
18kV và 20kV. Các điều kiện khác áp dụng ở các kết quả tối ưu đã thu được bao gồm:
- Hỗn hợp mẫu chuẩn tương ứng với nồng độ của Salbutamol 60,0 ppm, Metoprolol 60,0 ppm và Ractopamin 60,0 ppm
- Dung dịch đệm điện di là Arg/Ace (10mM), pH=4,9
- Bơm mẫu bằng phương pháp thủy động lực học theo kiểu xiphông ở độ cao 10cm, thời gian bơm mẫu 20s
Kết quả khảo sát thu được như trong bảng 3.5 và hình 3.7
Bảng 3.5.Ảnh hưởng của điện thế tách (E) đến thời gian di chuyển của các chất phân tích
Chất phân tích
Nồng độ (ppm)
Thời gian di chuyển (phút)
E= 10kV E= 15kV E = 18kV E= 20kV Sal 60,0 16,5 12,6 9,2 7,3 Met 60,0 17,1 12,8 9,3 7,5 Rac 60,0 17,5 13,1 9,5 7,7 1000 800 600 400 200
Thêi gian di chuyÓn (s)
20kV
18kV
15kV
10kV 20mV
Sal Met Rac
Hình 3.7. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của điện thế tách đến thời gian di chuyển và sự phân tách các pic
Khi áp thế từ 10 kV đến 20 kV, thời gian di chuyển của các chất giảm. Tại thế 10kV và 15kV các chất tách nhau tốt nhưng thời gian di chuyển của các chất khá lớn. Tại thế tách 10kV sau hơn 17 phút pic của chất thứ 3 mới xuất hiện còn tại thế tách 15kV là hơn 13 phút.
Với thế 20kV thời gian di chuyển của các chất ngắn hơn, cụ thể chỉ hơn 7 phút pic của chất thứ 3 đã xuất hiện nhưng kết quả phân tách giữa các pic kém. Vì khi tăng thế E, dòng điện I lớn sẽ gây ra hiệu ứng nhiệt Jun lớn làm nóng mao quản, làm giảm hiệu quả tách. Tại thế tách 18kV đạt hiệu quản tách tốt, thời gian phân tích phù hợp. Vì vậy chúng tơi lựa chọn thế 18kV là thế tách tối ưu.
Điều kiện tối ưu cho phân tích hỗn hợp Sal, Met và Rac bằng phương
pháp điện di mao quản CE-C4D được tổng hợp trong bảng 3.6
Bảng 3.6. Điều kiện tối ưu cho phân tích hỗn hợp Sal, Met, Rac bằng phương pháp CE-C4D
Các yếu tố Điều kiện