Từ các kết quả khảo sát ở hình 3.6 và bảng 3.4 có thể nhận thấy, khi tăng thời gian bơm mẫu, thời gian di chuyển của các chất hầu như không thay đổi hoặc thay đổi rất ít nhưng diện tích pic tăng tương ứng khi tăng thời gian bơm mẫu từ 10s đến 50s. Điều này hồn tồn phù hợp vì khi tăng thời gian bơm mẫu sẽ làm tăng lượng mẫu được bơm vào mao quản, tạo tín hiệu lớn hơn. Tuy nhiên, khi thời gian bơm mẫu dài tạo tín hiệu lớn hơn sẽ làm dịch chuyển đôi chút về thời gian di chuyển của các chất cũng như làm giảm độ phân giải giữa các pic. Ngoài ra, qua khảo sát sơ bộ thời gian bơm mẫu trên đối tượng mẫu thực tế là thức ăn chăn ni thì ngồi sự xuất hiện của các chất phân tích cịn có các cation gây ảnh hưởng, nếu thời gian bơm mẫu dài sẽ tạo các tín hiệu lớn của các cation. Do đó, chúng tơi lựa chọn thời gian bơm mẫu 20s là điều kiện tối ưu trong nghiên cứu này để thực hiện các khảo sát tiếp theo.
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thế đặt vào hai đầu mao quản
Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có nguồn thế (E) một chiều nhất định đặt vào hai đầu mao quản, nó điều khiển và duy trì sự điện di của các chất. Để có kết quả tốt và ổn định thì cần phải chọn thế thích hợp nhất và giữ cho thế này ln ổn định trong suốt q trình phân tách. Trên cơ sở trang thiết bị sẵn có và tham khảo tài liệu, các điện thế được lựa chọn khảo sát là: 10 kV, 15 kV,
18kV và 20kV. Các điều kiện khác áp dụng ở các kết quả tối ưu đã thu được bao gồm:
- Hỗn hợp mẫu chuẩn tương ứng với nồng độ của Salbutamol 60,0 ppm, Metoprolol 60,0 ppm và Ractopamin 60,0 ppm
- Dung dịch đệm điện di là Arg/Ace (10mM), pH=4,9
- Bơm mẫu bằng phương pháp thủy động lực học theo kiểu xiphông ở độ cao 10cm, thời gian bơm mẫu 20s
Kết quả khảo sát thu được như trong bảng 3.5 và hình 3.7
Bảng 3.5.Ảnh hưởng của điện thế tách (E) đến thời gian di chuyển của các chất phân tích
Chất phân tích
Nồng độ (ppm)
Thời gian di chuyển (phút)
E= 10kV E= 15kV E = 18kV E= 20kV Sal 60,0 16,5 12,6 9,2 7,3 Met 60,0 17,1 12,8 9,3 7,5 Rac 60,0 17,5 13,1 9,5 7,7 1000 800 600 400 200
Thêi gian di chun (s)
20kV
18kV
15kV
10kV 20mV
Sal Met Rac
Hình 3.7. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của điện thế tách đến thời gian di chuyển và sự phân tách các pic
Khi áp thế từ 10 kV đến 20 kV, thời gian di chuyển của các chất giảm. Tại thế 10kV và 15kV các chất tách nhau tốt nhưng thời gian di chuyển của các chất khá lớn. Tại thế tách 10kV sau hơn 17 phút pic của chất thứ 3 mới xuất hiện còn tại thế tách 15kV là hơn 13 phút.
Với thế 20kV thời gian di chuyển của các chất ngắn hơn, cụ thể chỉ hơn 7 phút pic của chất thứ 3 đã xuất hiện nhưng kết quả phân tách giữa các pic kém. Vì khi tăng thế E, dịng điện I lớn sẽ gây ra hiệu ứng nhiệt Jun lớn làm nóng mao quản, làm giảm hiệu quả tách. Tại thế tách 18kV đạt hiệu quản tách tốt, thời gian phân tích phù hợp. Vì vậy chúng tơi lựa chọn thế 18kV là thế tách tối ưu.
Điều kiện tối ưu cho phân tích hỗn hợp Sal, Met và Rac bằng phương
pháp điện di mao quản CE-C4D được tổng hợp trong bảng 3.6
Bảng 3.6. Điều kiện tối ưu cho phân tích hỗn hợp Sal, Met, Rac bằng phương pháp CE-C4D
Các yếu tố Điều kiện
Detector CE-C4D
Mao quản Mao quản silica, tổng chiều dài 60 cm, chiều dài hiệu dụng 53cm, đường kính trong 50µm
Phương pháp bơm mẫu Thủy động lực học kiểu xiphông: 10cm Thời gian bơm mẫu 20s
Dung dịch đệm điện di Arg/Ace (10mM) pH=4,9
Thế tách 18kV
3.2. Khảo sát các chất gây ảnh hưởng
Các đối tượng mẫu thực được lựa chọn để phân tích bao gồm mẫu dược phẩm và mẫu thức ăn chăn ni. Trong đó, khác với mẫu dược phẩm có thành phần khá đơn giản và được kiểm sốt chặt chẽ, thức ăn chăn ni có thành phần khá phức tạp, được sản xuất từ những sản phẩm có nguồn gốc từ khoáng vật, vi sinh vật, những sản phẩm hóa học và các thành phần khác. Tùy vào chất lượng của các loại thức ăn sẽ ảnh hưởng đến các sản phẩm chăn ni (ví dụ: thịt gia súc, gia cầm). Thức ăn chăn ni tốt thì sản phẩm chăn ni tốt và ngược lại nếu thức ăn bị nhiễm
các chất độc hại thì sản phẩm này bị tích tụ lại trong cơ thể vật nuôi và gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng khi ăn phải thức ăn đó. Chính vì vậy, trong thành phần của thức ăn chăn ni có chứa các ngun tố hóa học như canxi, natri, kali, magie, clo, iốt,… và các chất hữu cơ như protein, lipit, các vi chất dinh dưỡng… Do đó, để xác định hàm lượng các β-agonist (nếu có) trong thức ăn chăn nuôi, cần khảo sát ảnh hưởng của các cation này. Xét về mặt phân tích điện di thì các cation như K+, Ca2+, Na+, Mg2+,… khơng ảnh hưởng đến việc xác định các β- agonist bằng phương pháp CE-C4D, tuy nhiên nếu nền mẫu chứa hàm lượng đáng kể các cation này sẽ có thể gây ảnh hưởng đến đường nền và/hoặc sự xuất hiện tín hiệu của các chất phân tích.
Ảnh hưởng của các cation có thể có trong mẫu thức ăn được khảo sát bằng cách thêm chất chuẩn của từng cation với nồng độ thích hợp vào nền mẫu thức ăn đã được pha lỗng sau q trình xử lý mẫu. Kết quả được thể hiện trong hình 3.8.
800 600
400 200
Thêi gian di chun (s) 50mV K Ca Na Mg 1 2
Sal Met Rac
1. Nên mẫu thức ăn chưa
thêm chuẩn các cation
2. Nền mẫu thức ăn sau thêm các cation: 50ppm K, 50ppm Ca, 50ppm Na, 50ppm Mg Hình 3.8. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của các cation đến sự phân tách của
Từ kết quả khảo sát có thể nhận thấy sự xuất hiện của các cation nêu trên (nếu có) trong mẫu thức ăn chăn ni cũng không ảnh hưởng đến việc xác định các chất phân tích vì chúng xuất hiện ở khá xa và ngược chiều với pic của các chất phân tích.
3.3. Đánh giá phương pháp phân tích 3.3.1. Lập đường chuẩn 3.3.1. Lập đường chuẩn
Các dung dịch dùng để dựng đường chuẩn được pha loãng từ các dung dịch chuẩn gốc. Các dung dịch này có nồng độ biến thiên trong khoảng 2,5- 250,0 ppm. Mỗi dung dịch được bơm trên hệ điện di 3 lần, diện tích pic trung bình thu được sẽ là số liệu để dựng đường chuẩn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ. Các điều kiện đo trên cơ sở điều kiện tối ưu nêu ở bảng 3.6 và diện tích pic trung bình của các chất thu được như trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ Sal, Met, Rac
STT
Salbutamol Metoprolol Ractopamin
Nồng độ (ppm) Diện tích pic (mV.s) Nồng độ (ppm) Diện tích pic (mV.s) Nồng độ (ppm) Diện tích pic (mV.s) 1 2,5 2,3 2,5 1,9 2,5 2,1 2 5,0 5,1 5,0 3,8 5,0 4,3 3 10,0 8,9 10,0 7,9 10,0 8,7 4 20,0 18,5 20,0 16,7 20,0 17,3 5 50,0 47,2 50,0 41,0 50,0 45,0 6 100,0 100,2 100,0 81,4 100,0 91,7 7 150,0 144,5 150,0 116,8 150,0 140,6 8 200,0 301,8 200,0 247,2 200,0 289,3 9 250,0 398,8 250,0 317,8 250,0 423,7
Từ kết quả thu được ở bảng 3.7, sử dụng phần mềm Origin để dựng đường chuẩn và xử lý thống kê số liệu. Kết quả thu được như trên hình 3.9, hình 3.10, hình 3.11 và bảng 3.8. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Y = A + B * X Parameter Value Error ------------------------------------------------------------ A -0.28196 0.68338 B 0.97536 0.01025 ------------------------------------------------------------ R SD N P ------------------------------------------------------------ 0.99967 1.49631 8 <0.0001 ------------------------------------------------------------ D ien t ich pi c (m V .s) Nong do Sal (ppm)
Hình 3.9. Đường chuẩn của Salbutamol theo diện tích pic
0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 20 40 60 80 100 120 Y = A + B * X
Parameter Value Error ------------------------------------------------------------ A 0.38201 0.63116 B 0.78866 0.00947 ------------------------------------------------------------ R SD N P ------------------------------------------------------------ 0.99957 1.38196 8 <0.0001 ------------------------------------------------------------ D ie n t ic h p ic (m V .s ) Nong do Met (ppm)
Hình 3.10. Đường chuẩn của Metoprolol theo diện tích pic theo diện tích pic
0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Y = A + B * X Parameter Value Error ------------------------------------------------------------ A -0.69550.38796 B 0.93506 0.00582 ------------------------------------------------------------ R SD N P ------------------------------------------------------------ 0.99988 0.84946 8 <0.0001 ------------------------------------------------------------ D ie n ti ch p ic (m V .s) Nong do Rac (ppm)
Hình 3.11. Đường chuẩn của Ractopamin theo diện tích pic theo diện tích pic
Các kết quả khảo sát và tính tốn được trình bày trong bảng 3.8
Bảng 3.8. Phương trình đường chuẩn của Sal, Met và Rac
Tên chất Phương trình đường chuẩn (y=a+bx) Hệ số tương quan R
Sal y = (-0,28196±0,68338)+(0,97536±0,01028)x 0,99967
Met y = (0,38201 ±0,63116)+(0,78866±0,00947)x 0,99957
Rac y= (-0,6955±0,38796)+(0,93506±0,00582)x 0,99988
Với kết thu được ở trên cho thấy, các hệ số tương quan biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ chất phân tích là khá tốt (R ≥ 0,9995), đồng thời các giá trị P < 0,05 (đối với cả 3 chất phân tích) chứng tỏ x và y có quan hệ tuyến tính.
Đánh giá phương trình hồi qui của đường chuẩn *Kiểm tra sự sai khác của a với giá trị 0
Phương trình hồi quy có dạng: y = a + bx
Nếu xem a ≈ 0 thì phương trình trên được viết thành dạng yi = b’xi thay các giá trị yi, xi tương ứng vào ta được
Ta có Ftính= ; F(0,95;8;7) = 3,726
Bảng 3.9. Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phương trình đường chuẩn Sal, Met, Rac
Tên chất Sal Met Rac
0,9516 0,7891 0,8852
2,1362 1,8854 0,6409
5,9227 2,5040 14,6269
Ftính 0,3606 0,7529 0,0438
Như vậy, Ftính < Fbảng nên khơng có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa a và 0, tức là phương pháp không mắc sai số hệ thống.
3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp pháp
Để có kết luận chính xác về khoảng tuyến tính, chúng tơi tiến hành xác định các giá trị LOD và LOQ của phương pháp:
- Giới hạn phát hiện (LOD)
Để xác định giá trị LOD, dùng dung dịch chuẩn của các chất phân tích tiến hành pha lỗng với nồng độ nhỏ nhất mà vẫn thu được tín hiệu gấp 3 lần so với nhiễu đường nền (S/N=3). Nồng độ ban đầu của hỗn hợp chất chuẩn được lựa chọn cho cả ba chất Salbutamol, Metoprolol và Ractopamin là 60,0 ppm, sau đó tiến hành pha loãng nồng độ nhỏ dần và phân tích điện di. Các kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.10.
Bảng 3.10. Giới hạn phát hiện Sal, Met và Rac bằng phương pháp điện di mao quản CE-C4D
C
(ppm) Chất Chiều cao pic (S)
Tín hiệu nhiễu đường nền
(N) S/N 0,7 Sal 0,3851 0,04756 8,09 Meto 0,2155 4,53 Rac 0,2376 4,99 0,5 Sal 0,3065 0,07077 4,33
Meto - -
Rac - -
Như vậy, giới hạn phát hiện (LOD) theo phương pháp trực tiếp của Salbutamol là 0,5 ppm, của Metoprolol và Ractopamin là 0,7 ppm.
- Giới hạn định lượng (LOQ)
Theo lý thuyết thống kê trong hóa phân tích thì LOQ là nồng độ chất phân tích mà cho tín hiệu gấp 10 lần tín hiệu đường nền (S/N=10). Vì vậy, giới hạn định lượng của phương pháp xác định Sal, Met, Rac tương ứng là 1,7 ppm; 2,3 ppm và 2,3 ppm. Từ đó, có thể xác định khoảng tuyến tính của phương pháp CE-C4D xác định các chất Sal, Rac, Met như trong bảng 3.11. Trong đó, giá trị cận trên của khoảng tuyến tính cịn có thể tiếp tục tăng nữa, tuy nhiên trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ lựa chọn là 150 ppm để phù hợp với các đối tượng mẫu phân tích đã lựa chọn.
Bảng 3.11. Giá trị khoảng tuyến tính và LOD, LOQ của Sal, Met, Rac
Chất phân tích Khoảng tuyến tính (ppm) LOD (ppm) LOQ (ppm)
Salbutamol 1,7 – 150 0,5 1,7
Metoprolol 2,3 – 150 0,7 2,3
Ractopamin 2,3 – 150 0,7 2,3
3.3.3. Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi) - Độ chụm của thiết bị
Để đánh giá độ chụm của phương pháp, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại của Sal, Met và Rac ở 3 mức nồng độ 10,0 ppm; 40,0 ppm và 150,0 ppm. Mỗi mức nồng độ được tiến hành với 6 lần bơm mẫu độc lập. Kết quả thu được trình bày