- Độ chụm của thiết bị
3.4. Phân tích mẫu thực tế và đo đối chứng với phương pháp tiêu chuẩn HPLC
3.4.1.3. Mẫu thuốc chứa Metoprolol dạng viên
Mẫu thử được chuẩn bị theo quy trình:
Lấy 5 viên thuốc Plendil Plus, cạo sạch phần bao đường của từng viên. Sau đó nghiền nhỏ viên và trộn đều, được mẫu thử. Cân chính xác 5,0mg mẫu thử trên cân phân tích, chuyển mẫu vào bình dung tích 10,0 ml, thêm 5,0ml MeOH và siêu âm khoảng 10 phút sau đó định mức tới vạch bằng nước đề-ion. Hỗn hợp được ly tâm (8000 rpm) trong 10 phút. Dung dịch thu được được lọc qua màng 2 µm và được pha với tỉ lệ thích hợp trước khi tiến hành bơm mẫu vào thiết bị CE
Tiến hành xác định sự có mặt của Metoprolol có trong mẫu thuốc dạng viên bằng phương pháp thêm chuẩn Metoprolol ở các mức nồng độ khác nhau:
+ Mức 0: Không thêm chuẩn Metoprolol vào mẫu thử
+ Mức 1: Thêm 100µL dung dịch chuẩn Metoprolol 1000ppm vào 5,0 ml mẫu thử
+ Mức 2: Thêm 200µL dung dịch chuẩn Metoprolol 1000ppm vào 5,0 ml mẫu thử
+ Mức 3: Thêm 300µL dung dịch chuẩn Metoprolol 1000ppm vào 5,0 ml mẫu thử
Điện di đồ thêm chuẩn xác định sự có mặt Metoprolol trong mẫu thuốc được thể hiện trong hình 3.16.
700 600 500 400 300 200
Thêi gian di chun (s) Met 10mV
Hình 3.16. Điện di đồ xác định Metoprolol trong mẫu thuốc sau khi thêm chuẩn Metoprolol ở các nồng độ khác nhau
Căn cứ vào diện tích pic thu được trên điện di đồ, dựa vào phương trình đường thêm chuẩn (hình 4.1-c ở phần phụ lục) sẽ tính được nồng độ Metoprolol có trong mẫu thuốc. Kết quả thu được như trong bảng 3.21.
Bảng 3.21. Kết quả xác định nồng độ Metoprolol trong mẫu thuốc
CMet thêm chuẩn (ppm)
Mẫu thuốc chứa Metoprolol
Spic trung bình (mV.s) Hàm lượng Metoprolol tartrate trong 1 viên (mg) Hàm lượng Metoprolol tartrate trên nhãn trong 1 viên (mg) 20,0 37,9 64,47 ± 0,23 50,00 40,0 54,6 60,0 76,5
Việc kiểm tra khả năng xác định đồng thời sự có mặt của 3 chất Sal, Met và Rac trong nền mẫu thuốc dạng viên chứa Metoprolol bằng phương pháp CE-C4D cũng được thực hiện cho kết quả như trong hình 3.17.
700 600 500 400 300 200 100
Thêi gian di chuyÓn (s) 20mV Met Met Sal Rac Plendil + 0ppm SMR Plendil + 20ppm SMR
Hình 3.17. Điện di đồ xác định sự có mặt đồng thời của Sal, Met, Rac trong nền mẫu thuốc chứa Metoprolol
3.4.2. Kết quả phân tích mẫu thức ăn chăn nuôi
Mẫu thử được chuẩn bị theo quy trình đã nêu trong phần thực nghiệm: mẫu thức ăn chăn nuôi được nghiền thành bột, trộn đều. Cân chính xác 2,0 gam bột từ mỗi mẫu và chuyển bình có dung tích 10,0 ml. Thêm 8,0ml MeOH + 2,0ml H2O và tiến hành rung siêu âm trong khoảng 2 giờ. Sau đó dung dịch mẫu được lọc qua màng lọc 0,2 µm hai lần trước khi bơm mẫu vào thiết bị CE.
Mẫu thức ăn chăn nuôi được cung cấp bởi Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia. Đây là mẫu lưu đã phân tích có hàm lượng chất tạo nạc, tuy nhiên do mẫu đã lưu trong một thời gian khá dài nên khi tiến hành phân tích chỉ thấy tín hiệu khá nhỏ của Ractopamin, mặc dù nhỏ hơn giới hạn định lượng (LOQ) nhưng sơ bộ định lượng cho kết quả hàm lượng Ractopamin là 0,9 ppm. Điện di đồ thể hiện trong hình 3.18.
800 600
400 200
0
Thêi gian di chuyÓn (s)
Rac TACN + 20ppm Rac
TACN + 0ppm Rac 5mV
Hình 3.18. Điện di đồ xác định sự có mặt của Salbutamol trong mẫu thức ăn chăn nuôi bằng cách thêm chuẩn Salbutamol
Để kiểm tra khả năng xác định đồng thời các chất tạo nạc trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi, chúng tôi thêm hỗn hợp dung dịch chuẩn của các chất phân tích ở hai mức nồng độ khác nhau vào nền mẫu thức ăn sau khi xử lý:
+ Mức 1: Thêm 0,3 ml dung dịch chuẩn SMR 1000ppm vào 5,0 ml mẫu thử
+ Mức 2: Thêm 0,5 ml dung dịch chuẩn SMR 1000ppm vào 5,0 ml mẫu thử
800 600
400 200
0
Thêi gian di chuyÓn (s)
Sal Met Rac
K Ca Na Mg
0ppm SMR 50ppm SMR
100ppm SMR 50mV
Hình 3.19. Điện di đồ thêm dung dịch chuẩn hỗn hợp các chất phân tích ở các nồng độ khác nhau trong nền mẫu thức ăn chăn nuôi
Căn cứ vào diện tích pic thu được trên điện di đồ, dựa vào phương trình đường chuẩn của các chất trong bảng 3.8 có thể tính được hiệu suất thu hồi của các chất phân tích. Kết quả thu được như trong bảng 3.22.
Bảng 3.22. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi của các chất phân tích trong mẫu thức ăn chăn ni
Tên chất Nồng độ chuẩn thêm vào (ppm) Nồng độ phân tích được (ppm)
Hiệu suất thu hồi (%)
Hiệu suất thu hồi trung bình (%) Mức 1 Mức 2 Mức 1 Mức 2 Mức 1 Mức 2 Sal 50,0 100,0 50,5 97,4 101,0 97,4 99,2 Met 50,0 100,0 50,3 106,7 100,6 106,7 103,7 Rac 50,0 100,0 50,0 97,6 100,0 97,6 98,8
Từ kết quả thu được ở bảng 3.22 cho thấy, độ thu hồi của các chất khá cao, từ 98,8% - 103,7%. Vì vậy, có thể kết luận phương pháp phân tích là đáng tin cậy.
3.4.3. Phân tích đối chứng phương pháp CE-C4D với phương pháp HPLC
Kết quả hàm lượng Sal (có trong thuốc salbutamol dạng viên, thuốc Solmux Broncho dạng xi-rơ) và Met (có trong thuốc Plendil Plus) xác định bằng phương pháp CE-C4D được phân tích đối chứng với phương pháp tiêu chuẩn Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia. Các kết quả này được trình bày trong bảng 3.23:
Bảng 3.23. Kết quả phân tích đối chứng hàm lượng Sal và Met trong mẫu thuốc với phương pháp tiêu chuẩn HPLC
Tên thuốc
Hàm lượng chất phân tích thu được với phương pháp CE -
C4D
Hàm lượng chất phân tích
thu được với phương HPLC Hàm lượng chất phân tích ghi trên nhãn % sai khác giữa hai phương pháp Salbutamol 3,51 ±0,11 (mg/viên) 3,40 (mg/viên) 4,00 (mg/viên) 3,23 Solmux Broncho 0,17 ± 0,01 (mg/g) 0,15 (mg/g) 0,20 (mg/g) 13,31 Plendil Plus 64,47 ± 0,23 (mg/viên) 60,00 (mg/viên) 50,00 (mg/viên) 7,45
Từ kết quả bảng 3.23 cho thấy, sai số giữa hai phương pháp dao động trong khoảng 3,23% - 13,31%. Điều này cho thấy cho thấy hàm lượng của Salbutamol và Metoprolol thu được theo hai phương pháp khá phù hợp. Như vậy, có thể sử dụng phương pháp CE-C4D để xác định hàm lượng của các β-agonist trong mẫu dược phẩm, thức ăn chăn nuôi,… và mở rộng nghiên cứu cho các đối tượng mẫu khác.
3.5. Hướng phát triển của đề tài
Do điều kiện hạn chế về thời gian nên chúng tôi chỉ tiến hành nghiên cứu tách và xác định hàm lượng của ba chất thuộc họ β- agonist trong mẫu dược phẩm và mẫu thức ăn chăn ni. Phương pháp cịn có thể mở rộng nghiên cứu với các đối tượng mẫu khác như: mẫu nước tiểu, mẫu máu… hay các mẫu môi trường như:
nước thải bệnh viện, nước thải trại chăn nuôi gia súc… nhằm phát triển phương pháp hướng vào áp dụng cho các vấn đề thực tiễn ở Việt Nam.
KẾT LUẬN
Qua cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng phương pháp điện di mao quản tích hợp detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE- C4D) để tách và xác định đồng thời các β-agonist Salbutamol, Metoprolol, Ractopamin trong mẫu dược phẩm và thực phẩm, luận văn đã thu được các kết quả sau:
- Đã tối ưu được các điều kiện tách và xác định đồng thời 3 chất thuộc họ β- agonist (Sal,Met và Rac) bằng phương pháp CE - C4D. Các điều kiện tối ưu bao gồm: detector: CE - C4D; dung dịch diện ly: đệm Arg/Ace (10mM) pH=4,9; Thế điện di: 18kV; Sử dụng mao quản silica trần, tổng chiều dài 60 cm, chiều dài hiệu dụng 53cm, đường kính trong 50µm; Thời gian bơm mẫu: 20s; Phương pháp bơm mẫu: thủy động lực học kiểu xiphông, h = 10cm. Thứ tự các chất tách được với mao quản silica là: Salbutamol, Metoprolol, Ractopamin. Khi xác định các β-agonist trong dược phẩm và thức ăn chăn ni thì nền mẫu bị ảnh hưởng bởi các cation: K+, Ca2+, Na+, Mg2+.
- Đánh giá được phương pháp phân tích: xây dựng đường chuẩn xác định 3 chất trong khoảng nồng độ 2,5 – 250,0 ppm, tính tuyến tính (các giá trị R2 đều lớn hơn 0,999), độ lặp lại (các giá trị RSD đề nhỏ hơn 3), độ đúng (hiệu suất thu hồi của Sal, Met và Rac đạt trong khoảng 99% - 99,5%), giới hạn phát hiện (LOD) của Sal, Met và Rac lần lượt là 0,5 ppm; 0,7 ppm và 0,7 ppm; giới hạn định lượng (LOQ) của Sal, Met và Rac lần lượt là 1,7 ppm; 2,3 ppm và 2,3 ppm.
- Ứng dụng phương pháp để phân tích hàm lượng Sal và Met trong mẫu dược phẩm và xác định sự có mặt đồng thời cả 3 chất (Sal, Met, Rac) trong nền mẫu thức ăn chăn nuôi. Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi khá cao từ 98,8% - 103,7%.
- Tiến hành đo đối chứng xác định hàm lượng Sal, Met bằng phương pháp CE - C4D với phương pháp tiêu chuẩn HPLC. Kết quả thu được cho thấy sai số giữa hai phương pháp dao động trong khoảng 3,23% - 13,31%. Điều này cho thấy hàm lượng Sal, Met thu được từ hai phương pháp khá phù hợp.
Từ các kết quả thu được,chúng tôi nhận thấy phương pháp điện di mao quản tích hợp detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) phù hợp với việc xác định đồng thời hàm lượng Sal, Met và Rac trong dược phẩm/thức ăn chăn ni. Phương pháp cũng có thể phát triển để trở thành công cụ hữu hiệu để thanh tra và kiểm định chất lượng sản phẩm phục vụ trong lĩnh vực an toàn thực phẩm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2002) - 54/2002/QĐ-BNN – ngày 20/06/2002 – Một số loại kháng sinh, hóa chất cấm sử dụng trong sản xuất
và kinh doanh thức ăn chăn nuôi.
2. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2012) - 649/BNN-CN – ngày 15/03/2012- Kiểm sốt chất cấm trong chăn ni.
3. Bộ Y tế (2012) – 10031/QLD-KD – ngày 07/06/2012 – Thông tư quy định về việc kinh doanh, sử dụng thuốc thành phẩm, nguyên liệu thuộc nhóm β- agonist.
4. Đồn Thị Khang, Phan Thanh Đạm, Dương Thị Thu Anh và Đào Đức Hảo (2008), “Ứng dụng kỹ thuật ELISA để xác định Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn ni”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Chăn ni, 13, trang 1-6.
5. Nguyễn Thị Ánh Hường (2010), Nghiên cứu xác định các dạng asen vô cơ trong nước ngầm bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc, Luận án Tiến sĩ Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên - ĐHQGHN.
6. Nguyễn Văn Ri (2011), Các kỹ thuật phân tích Điện di, Sách chuyên đề cao
học, Đại học khoa học Tự nhiên - ĐHQG Hà Nội.
7. Nguyễn Văn Ri (2011), Các phương pháp tách sắc ký, Sách chuyên đề cao học, Đại học khoa học Tự nhiên-ĐHQG Hà Nội.
8. Phạm Luận(2005), Cơ sở lý thuyết của Sắc kí điện di mao quản hiệu năng cao, Giáo trình giảng dạy dành cho sinh viên chuyên ngành Hóa Phân tích, Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên Hà Nội.
9. Tạ Thị Thảo (2010), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hóa phân tích, ĐH
Quốc gia Hà Nội.
10. Viện kiểm nghiệm ATVSTP Quốc Gia (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật Hà Nội.
TIẾNG ANH
11. C. Juan, C. Igualada, F. Moragues, N. Ln, J. Mes (2010), “Development and validation of a liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the analysis of β-agonists in animal feed and drinking water”,
Journal of Chromatography A, 1217, pp. 6061 – 6068.
12. CHU, Qing-Cui(楚清脆) GENG, Cheng-Huai(耿成怀) ZHOU, Hui(周惠)YE, Jian-Nong(叶建农) (2007), “Fast determination of Clenbuterol and Salbutamol in feed and meat products based on miniaturized capillary electrophoresis with amperometric detection”, Chinese Journal of Chemistry, 25, pp. 1832-1835.
13. Chun Hua Qu, Xian Liang Li, Lei Zhang , Cun Xian Xi , Guo Ming Wang, Nian Bing Li, Hong Qun Luo (2011), “Simultaneous Determination of Cimaterol, Salbutamol, Terbutaline and Ractopamin in Feed by SPE Coupled to UPLC”, Chromatographia, 73, pp. 243–249.
14. Donald H. Beermann, Frank R. Dunshea (2005), Metabolic Modifiers for Use in
Animal Production, Council for agricultural science and technology.
15. F R Dunshea, R H King and R G Campbell (1993), “Interrelationships between dietary protein and Ractopamin on protein and lipid deposition in finishing gilts”, Journal animal of science, 71, pp. 2931-2941.
16. Fabiana S. Felix, Maria S.M. Quintino, Alexandre Z. Carvalho, Lúcia H.G. Coelho, Claudimir L. do Lago, Lúcio Angnes (2006), “Determination of
salbutamol in syrups by capillary electrophoresis with contactless conductivity detection (CE-C4D)”,Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis, 40, pp. 1288–1292.
17. H.H.D.MEYER, L.RINKE and IDURSCH (1991), Residue screening for the β- agonists clenbuterol, salbutamol and cimaterol in urine using enzyme immunoassay and high-perfomance liqiud chromatography, Journal of Chromatography, 564, pp. 551-556.
18. Harry J. Mersmann (1998), “Overview of the effects of β-Adrenergic Receptor Agonists on animal growth including mechanisms of action”, American Society of Animal Science, 76, pp. 160–172.
19. Hongyuan Yan , Ruiling Wang, Yehong Han, Suting Liu (2012), “Screening, recognition and quantitation of salbutamol residues in ham sausages by molecularly imprinted solid phase extraction coupled with high- performance liquid chromatography–ultraviolet detection”, Journal of Chromatography B, 900, pp. 18-23.
20. Hong Zheng, Li-Gang Deng, Xiao Lu, Shan-Cang Zhao, Chang-Ying Guo, Jiang-Sheng Mao, Yu-Tao Wang, Guo-Sheng Yang, Hassan Y. Aboul- Enein (2010), “UPLC-ESI-MS-MS determination of three β-Agonists in Pork”, Chromatographia, 72, pp. 79-84.
21. JianliZhang, YouxuanXu, XinDi, MoutianWu (2005), “Quantitation of salbutamol in human urine by liquid chromatography – electrospray ionization mass spectrometry”, Journal of Chromatography B, 831, pp. 328 – 332.
22. Leena Suntornsuk (2007), “Capillary Electrophoresis in Pharmaceutical Analysis: A Survey on Recent Applications”, Journal of Chromatographic Science, Vol. 45, pp. 559-578.
23. LiQi Wang, LiMin He, Zhong Wang, XuFeng Wang, JianHua Shu, JianWen Yang, GaoKui Zhang and ZhenLing Zeng (2013), “Selection of a representative matrix for the multiresidue analysis of nine β-agonists in animal tissues and urine with LC-MS/MS”, Analyst, 138, pp.4579-4584. 24. Magda Caban, Piotr Stepnowski, Marek Kwiatkowski, Natalia Migowska,
Jolanta Kumirska (2011), “Determination of β-blockers and β-agonists using gas chromatography and gas chromatography–mass spectrometry – A comparative study of the derivatization step”, Journal of Chromatography A, 1218, pp. 8110– 8122.
25. Milagro Reig, Natalia Batlle, José Luis Navarro, Fidel Toldrá (2004), “Stability of agonist methyl boronic derivatives before gas chromatography-mass spectrometry analysis”, Analytical Chimica Acta, 529, pp.293-297.
26. Muniyandi Rajkumar, Ying-Sheng Li, Shen-Ming Chen, (2013) “Electrochemical detection of toxic Ractopamin and salbutamol in pig meat and human urine samples by using poly taurine/zirconia nanoparticles modified electrodes”, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 110, pp. 242– 247.
27. Peter Mikuš, Iva Valášková (2005), Emil Havránek, “Determination of Salbutamol in Pharmaceuticals by Capillary Electrophoresis”, Arch. Pharm.
Chem. Life Sci, 338, pp. 498-501.
28. Primal Sharma, Pritesh Contractor, Swati Guttikar , Daxesh P. Patel, Pranav S. Shrivastav (2014), “Development of a sensitive and rapid method for quantitation of (S)-(-)- and (R)-(+)-metoprolol in human plasma by chiral LC–ESI–MS/MS, Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(1), pp. 63–79. 29. Thanh Duc Mai (2011), Capacitively coupled contactless conductivity detection
electro-chromatography, Chemistry Dotoral Thesis, University of Basel, Switzerland.
30. Tianshu Zhou, Qin Hu, Hui Yu, Yuzhi Fang (2001), “Separation and determination of β -agonists in serum by capillary zone electrophoresis with amperometric detection”, Analytica Chimica Acta , 441, pp. 23–28.
31. Wang Xiu-Juan, Zhang Feng, Ding Fei, Li Wei-Qing, Chen Qing-Yu, Chu Xiao-Gang, Xu Cheng-Bao (2013), “Simultaneous determination of 12 β- agonists in feeds by ultra-high-performance liquid chromatography- quadrupole-time-of-flight mass spectrometry”, Journal of Chromatography A, 1278, pp. 82– 88.
32. Wei Du, Qiang Fu, Gang Zhao, Ping Huang, Yuanyuan Jiao, Hao Wu, Zhimin Luo, Chun Chang (2013), “Dummy-template molecularly imprinted solid phase extraction for selective analysis of Ractopamin in pork”, Food Chemistry, 129, pp. 24-30.
33. Weiyu Wang, Yulian Zhang, Jinyan Wang, Xue Shi, Jiannong Ye (2010), “Determination of β-agonists in pig feed, pig urine and pig liver using capillary electrophoresis with electrochemical detection”, Meat Science, 85, pp. 302–305.
34. Xiaoyun Lin, Yongnian Ni, Serge Kokot (2013), “A novel electrochemical sensor for the analysis of β-agonists: The poly(acid chrome blue K)/graphene oxide-nafion/glassy carbon electrode”, Journal of Hazardous Materials, 260, pp. 508-517.
PHỤ LỤC
Hình 4.1. Đường thêm chuẩn của Salbutamol và Metoprolol trong mẫu thuốc
Y = A + B * X
Parameter Value Error
---------------------------------------------------------