CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐỐN EV TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM
1.3.4. Phƣơng pháp sinh học phân tử
1.3.4.1. Phƣơng pháp RT-PCR
Do EVs có cấu trúc gen là RNA nên phƣơng pháp sinh học phân tử đƣợc áp dụng là reverse transcription PCR (RT-PCR) hay còn gọi là PCR phiên mã ngƣợc là một kỹ thuật sử dụng RNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên chuỗi DNA bổ sung (cDNA), gồm 2 giai đoạn: 1-Giai đoạn thứ nhất tổng hợp cDNA từ RNA dƣới tác dụng của enzyme phiên mã ngƣợc và các mồi oligo-(T) hoặc các mồi ngẫu nhiên; 2-giai đoạn nhân bản gen quan tâm từ cDNA bằng PCR với các mồi đặc hiệu.
RNA đƣợc cấu tạo nhờ bốn loại nucleotide (adenine, guanine, cytosine và uracil) liên kết với nhau tạo thành một chuỗi đơn. Khi chuỗi nucleotide này đƣợc biến đổi thành DNA thì uracil (U) đƣợc thay thế bằng thymine (T).
Phản ứng biến đổi RNA hệ gen thành sợi DNA thứ nhất phải nhờ đến một enzyme phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase) do vậy giai đoạn này đƣợc gọi là phiên mã ngƣợc (RT), sau đó q trình tổng hợp sợi DNA thứ hai lại nhờ một enzyme khác là DNA polymerase I.
Khi đã có DNA sợi đơi từ khn mẫu RNA thì phản ứng tiếp theo sẽ là khuếch đại gen nhờ kỹ thuật PCR đƣợc thực hiện với ba mức nhiệt độ phù hợp ở mỗi chu kỳ. Toàn bộ phản ứng khuếch đại một đoạn DNA từ khuôn mẫu RNA trải qua hai giai đoạn nói trên đƣợc gọi là RT-PCR [61].
Kỹ thuật RT-PCR từ lâu đã đƣợc ứng dụng trong chẩn đoán đối với EVs hay để chẩn đốn đặc hiệu lồi, đặc hiệu serotype. Trong đó, ứng dụng kỹ thuật RT- PCR chẩn đốn EVs thực sự có ý nghĩa trong điều trị lâm sàng, chẩn đốn đặc hiệu loài hay serotype ứng dụng kỹ thuật RT-PCR thực sự có ích khi sàng lọc các chủng hay các lồi khơng điển hình, phân biệt chủng polio hoang dại từ các chủng EVs không phải polio, hoặc với các chủng vaccine và xác định đặc hiệu serotype nhƣ
Các xét nghiệm sinh học phân tử chẩn đoán EVs từ các mẫu bệnh phẩm lâm sàng thƣờng có trình tự đích có tính bảo thủ cao nằm ở vùng 5'UTR, cho phép xác định tất cả các thành viên trong chi EVs. Rất nhiều subtype EVs không thể nhân lên nhanh chóng ở mơi trƣờng ni cấy tế bào, do đó các xét nghiệm chẩn đoán dựa vào phƣơng pháp RT-PCR thƣờng nhạy hơn các phƣơng pháp cổ điển. Vì phƣơng pháp RT-PCR có độ nhạy và thời gian chẩn đốn nhanh hơn nuôi cấy, kết quả của phƣơng pháp này lại có sự tƣơng quan rất lớn với khung thời gian trong điều trị lâm sàng nên RT-PCR nhanh chóng trở thành tiêu chuẩn vàng mới trong chẩn đoán EV. Mặc dù, trên bề mặt chung RT-PCR có độ nhạy cao hơn nhƣng nó thƣờng chỉ dùng để chẩn đốn đặc hiệu chi và chỉ cho kết quả EV âm tính hoặc EV dƣơng tính mà ít đƣợc sử dụng để chẩn đốn đặc hiệu serotype.
Trình tự gen VP1 của vỏ capsit có sự tƣơng quan với xác định serotype bằng các phƣơng pháp xác định kháng nguyên và đây chính là đích lý tƣởng cho các xét nghiệm chẩn đốn EVs và các subtype EVs. Chính vì vậy rất nhiều nhà khoa học trên thế giới dựa vào trình tự trên vùng gen VP1 để phát triển các cặp mồi phục vụ cho chẩn đoán và nghiên cứu EVs và các subtype của EV [45]
Hình 1.11: Nguyên lý phản ứng RT-PCR 1.3.4.2. Phƣơng pháp realtime RT-PCR
Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại đƣợc phát hiện qua phân tích điểm kết thúc, bằng cách điện di ADN trên gel agarose khi phản ứng kết thúc.Ngƣợc lại, realtime PCR cho phép phát hiện và định lƣợng sự tích lũy ADN
khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra.
Ƣu điểm chính của realtime PCR so với PCR truyền thống là nó cho phép xác định số lƣợng bản sao khuôn mẫu ban đầu với sự chính xác và độ nhạy cao trong một phạm vi biến thiên rộng. Thêm vào đó, dữ liệu realtime PCR có thể đƣợc đánh giá trực tiếp mà khơng cần phải điện di trên gel, giúp tiết kiệm thời gian và gia tăng số lƣợng thí nghiệm thực hiện.Cuối cùng, việc tiến hành phản ứng và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống ống đóng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm và loại bỏ những thao tác sau phản ứng khuếch đại.
Cơ chế hoạt động của realtime PCR
Để hiểu cơ chế hoạt động của realtime PCR, hãy xem một đồ thị khuếch đại DNA mẫu (Hình 1.12). Trên đồ thị này, số chu kỳ PCR đƣợc thể hiện trên trục x, và tín hiệu huỳnh quang từ phản ứng, tỷ lệ với lƣợng sản phẩm khuếch đại trong ống phản ứng, đƣợc thể hiện trên trục y.
Đồ thị khuếch đại thể hiện 2 giai đoạn, giai đoạn một theo hàm mũ và giai đoạn hai bão hịa khơng theo hàm mũ. Trong giai đoạn hàm mũ, lƣợng sản phẩm PCR gần nhƣ đƣợc gấp đôi sau mỗi chu kỳ. Khi phản ứng tiếp diễn, các thành phần phản ứng đƣợc sử dụng và sau cùng, một hay nhiều thành phần trở nên cạn kiệt. Từ thời điểm này, phản ứng chậm lại và bƣớc vào giai đoạn bão hòa (chu kỳ 28-40 trong hình 1.12)
.
Hình 1.12. Biểu đồ quan hệ giữa chu kỳ và tín hiệu huỳnh quang trong phản ứng realtime PCR
Ban đầu, tín hiệu cịn ở mức tín hiệu nền, ta khơng thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu (chu kỳ 1-18 ở Hình 1.12) cho dù sản phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã đƣợc tạo ra đủ để tín hiệu huỳnh quang có thể đƣợc phát hiện. Và chu kỳ mà tại đó điều này xảy ra đƣợc gọi là chu kỳ ngƣỡng (Cycle of Threshold-Ct). Do chu kỳ ngƣỡng đƣợc đo lƣờng trong giai đoạn hàm mũ khi các thành phần phản ứng chƣa cạn kiệt, Realtime PCR có thể đƣợc sử dụng để tính tốn một cách chính xác và tin cậy lƣợng ban đầu của mẫu hiện diện trong phản ứng.
Chu kỳ ngƣỡng của một phản ứng đƣợc xác định chủ yếu bởi lƣợng khuôn mẫu hiện diện lúc phản ứng khuếch đại bắt đầu. Nếu lƣợng ban đầu của mẫu lớn, chỉ sau một vài chu kỳ, sản phẩm khuếch đại đã tích lũy đủ cho tín hiệu huỳnh quang cao hơn tín hiệu nền. Nhƣ vậy, phản ứng sẽ có chu kỳ ngƣỡng thấp. Ngƣợc lại, nếu lƣợng mẫu ban đầu thấp, sẽ cần nhiều chu kỳ khuếch đại hơn để tín hiệu huỳnh quang cao hơn tín hiệu nền. Vì vậy, phản ứng sẽ có chu kỳ ngƣỡng cao. Phản ứng sử dụng Taqman probe
Phản ứng sử dụng Taqman probe sử dụng một trình tự oligonucleotide đặc hiệu, gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dò Taqman (Taqman Probe), cùng với các primer. Hình 1.13 trình bày cơ chế hoạt động của Taqman Probe cũng đƣợc biết đến nhƣ là phản ứng 5’exo-nuclease, phản ứng Taqman sử dụng khả năng 5’-exonulease của các polymerase chịu nhiệt hiện nay, nhƣ là Taq hay Tth. Probe gắn một chất
phát huỳnh quang ở đầu 5’ và một chất hấp thụ huỳnh quang ở đầu 3’. Khi cịn ngun vẹn, tín hiệu của chất phát huỳnh quang bị hấp thụ do chúng nằm gần chất hấp thụ. Trong giai đoạn kết hợp bắt cặp và kéo dài DNA trong phản ứng khuếch đại, probe liên kết với trình tự đích và hoạt động 5’-3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đôi của Taq hay Tth sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang. Kết quả là, chất phát huỳnh quang bị tách rời khỏi chất hấp thụ, và tín hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lƣợng sản phẩm khuếch đại trong mẫu.Một cặp chất phát và hấp thụ huỳnh quang thƣờng đƣợc sử dụng là fluorescein (FAM, phát ra huỳnh quang xanh) và Black Hole Quencher 1 [62].
Hình 1.13: Cơ chế hoạt động của Taqman Probe Những tiêu chuẩn của một phản ứng PCR định lƣợng tối ƣu
Do PCR định lƣợng dựa trên mối quan hệ giữa lƣợng khuôn mẫu ban đầu và giá trị chu kỳ ngƣỡng thu đƣợc từ phản ứng khuếch đại, một phản ứng Realtime PCR tối ƣu là rất cần thiết cho việc định lƣợng chính xác và lặp lại mẫu thí nghiệm. Những tiêu chuẩn của một phản ứng PCR định lƣợng tối ƣu gồm:
-Đƣờng chuẩn tuyến tính (R2 > 0,980 hay r > |-0,990|) -Hiệu quả khuếch đại cao (90-105%)
-Mức độ đồng nhất qua các phản ứng lặp lại.
Một cách hiệu quả để đánh giá mức độ tối ƣu của một phản ứng PCR định lƣợng là chạy một loạt các độ pha loãng của một mẫu và sử dụng các kết quả có đƣợc để tạo ra một đƣờng chuẩn. Mẫu thí nghiệm có thể là một mục tiêu đã biết trƣớc nồng độ (ví dụ, nanogram của bộ gen, số bản sao của một plasmid) hay một mẫu chƣa biết nồng độ (ví dụ, cDNA). Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng bằng cách vẽ đồ thị giá trị logarit lƣợng mẫu ban đầu (hay hệ số pha loãng của mẫu chƣa biết nồng độ) với giá trị chu kỳ ngƣỡng thu đƣợc trong phản ứng khuếch đại của từng độ pha lỗng. Phƣơng trình hồi quy tuyến tính, với hệ số tƣơng quan Pearson (r) hay hệ số xác định (R2), đƣợc sử dụng để đánh giá mức độ tối ƣu của phản ứng PCR định lƣợng.
Hình 1.14. Biểu đồ phản ứng định lƣợng Realtime PCR
Lý tƣởng nhất là dãy pha loãng tạo ra những đƣờng đồ thị khuếch đại với các khoảng cách bằng nhau, nhƣ Hình 1.12. Nếu sau mỗi chu kỳ, lƣợng sản phẩm tạo ra đều tăng gấp đơi, thì khoảng cách giữa các đƣờng đồ thị tín hiệu huỳnh quang sẽ đƣợc xác định bằng phƣơng trình 2n
= hệ số pha lỗng, trong đó n là số chu kỳ khoảng cách giữa các đƣờng đồ thị ở ngƣỡng tín hiệu huỳnh quang.
Ví dụ, với một dãy pha lỗng theo hệ số 10, phƣơng trình là 2n = 10. Nhƣ vậy, n = 3,32, nghĩa là các giá trị chu kỳ ngƣỡng cần phải cách nhau 3,32 chu kỳ. Những khoảng cách bằng nhau của đồ thị khuếch đại sẽ tạo ra một đƣờng chuẩn tuyến tính, nhƣ Hình 1.14B. Phƣơng trình và giá trị r của đƣờng hồi quy tuyến tính đƣợc trình bày ở phía trên đồ thị.
Giá trị r hay R2 của đƣờng chuẩn biểu thị sự phù hợp giữa dữ liệu thí nghiệm thu nhận và đƣờng hồi quy, hay chính là mức độ tuyến tính của dữ liệu. Mức độ tuyến tính cho phép đo lƣờng sự biến thiên giữa các lần lặp lại và hiệu quả khuếch đại trên các mẫu có lƣợng ban đầu khác nhau. Sự khác biệt lớn của giá trị chu kỳ ngƣỡng qua các lần lặp lại sẽ làm giảm giá trị r hay R2. Trong phản ứng PCR định lƣợng, giá trị tuyệt đối của r cần phải trên 0,990 hay giá trị R2 phải lớn hơn 0,980.
Công bố đầu tiên về ba bộ mồi và probe sử dụng trong chẩn đoán EVsxuất hiện vào giữa năm 1989 và 1990, tất cả những bộ mồi và probe này đều có phản ứng rộng rãi với nhiều serotype EVs và đặc biệt là chúng có độ đặc hiệu cao với EVs. Phần lớn các bộ mồi và probe này đều đƣợc thiết kế nằm trên đoạn gen có tính bảo thủ cao trong vùng 5'UTR. Sau này có rất nhiều bộ mồi và probe đã đƣợc thiết kế và đƣợc ứng dụng trong chẩn đốn, chúng có độ nhạy cao hơn ni cấy và ddtj đƣợc độ đặc hiệu lý tƣởng lên tới 100%. Một trong những bộ mồi và probe đã đƣợc cải tiến đểthích nghi với kỹ thuật một bƣớc trong một ống nghiệm để cho kết quả trong năm giờ ứng dụng trong chẩn đốn virus lâm sàng. Chẩn đốn nhiễm EVs có thời gian rút ngắn ít hơn một ngày thực sự có ý nghĩa lớn trong điều trị và quản lý bệnh nhân cũng nhƣ chi phí ngƣời bệnh phải bỏ ra. Hai nghiên cứu lâm sàng lớn trên các mẫu dịch não tủy của 658 bệnh nhân có triệu chứng viêm não do EVs, các nhiễm trùng thần kinh khác và các mẫu âm tính để làm kiểm chứng. Kết quả kỹ thuật realtime RT-PCR đƣợc so sánh với kết quả ni cấy và chẩn đốn lâm sàng có độ nhạy từ 94,7% tới 96,3%, độ đặc hiệu từ 94,7% tới 99%, giá trị tiên lƣợng dƣơng tính từ 94,7% tới 96,3% và giá trị tiên lƣợng âm tính từ 97,4% tới 99%. Trong một nghiên cứu khác về nhiễm EVs ở trẻ sơ sinh sử dụng cúng phƣơng pháp nhƣ nghiên cứu trên với bệnh phẩm là serum và nƣớc tiểu cho kết quả realtime RT-PCR có độ nhạy cao gần gấp 3 lần nuôi cấy và độ đặc hiệu lên tới 100%. Nghiên cứu tiếp tục mở rộng trên các dịch cơ thể khác nhƣ máu, dịch họng và phân. Cuối cùng các xét nghiệm định lƣợng EVs cũng đƣợc công bố, những xét nghiệm này đã trở thành yếu tố quan trọng trong các phác đồ điều trị virus[12].