2.1.4 .Thời gian nghiên cứu
2.3.4. Các bƣớc tiến hành chẩn đoán
2.3.4.1. Tách chiết RNA tổng số bằng kit QIAamp Viral RNA mini kit
Nguyên lý: QIAamp Viral Mini Kits đã đƣa ra phƣơng pháp tách chiết RNA virus chung. Kit kết hợp màng silicagel có khả năng gắn chọn lọc với công nghệ máy ly tâm loại nhỏ hoặc máy hút chân không đồng thời cũng là một phƣơng pháp lý tƣởng cho việc tách chiết nhiều mẫu một lúc.
Quy trình tách chiết này dùng để tách chiết RNA tổng số từ 140 µl plasma, serum, nƣớc tiểu, môi trƣờng nuôi cấy tế bào, hoặc các dịch vô trùng trên cơ thể sử dụng máy li tâm loại nhỏ. Nếu sử dụng lƣợng mẫu ban đầu lớn hơn trong quá trình tiến hành sẽ đƣa mẫu lên cột nhiều lần hơn.
Các bƣớc chuẩn bị: Nhỏ 310 µl đệm AVE vào ống carriercó chứa 310 µg lyophilized carrier RNA để thành dung dịch có 1 µg/ µl rồi cho tồn bộ 310 µl AVE có chứa carrier vào lọ chứa 31ml AVL
Thêm 125ml cồn 96% - 100% vào 95 ml AW1, 160 ml cồn 96% - 100% vào 66 ml AW2.
Các bƣớc tiến hành:
Nhỏ 560 µl đệm AVL có chứa carrier vào ống eppendoft có thể tích 1.5ml.Thêm 140 µl mẫu cần tách RNA vào ống trên rồi voltex trong 15 giây để tạo thành một dung dịch đồng nhất.
Ủ hỗn hợp gồm mẫu và AVL có chứa carrier ở nhiệt độ phịng trong 10 phút.
Ly tâm nhẹ để loại bỏ hết các hạt chất lỏng nhỏ trên lắp ống.Thêm 560 µl cồn (96%-100%) vào mẫu, rồi voltex thật kỹ trong 15 giây.
Lấy cột ra và đặt vào ống collection, loại bỏ ống collection có chứa dịch thải.Lặp lại bƣớc hút mẫu vừa rồi.
Nhỏ 500 µl AW1, đậy nắp và tiếp tục ly tâm 8000 rpm/1 phút.Loại bỏ ống collection có chứa dịch thải, đặt cột vào ống collection mới.
Thêm 500 µl AW2 vào cột, li tâm ở 13000rpm/ 3 phút.
Cuối cùng đặt cột vào ống eppendoft 1,5ml loại bỏ dịch thải và thêm 60 µl AVE vào cột và ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 8000rpm/phút. RNA đã tách chiết đƣợc lƣu giữ trong ống eppendoft này, có thể lƣu giữ 1 năm trong tủ -20oC hoặc-70o
C 2.3.4.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán EVs và EV71
RNA của EVs đƣợc chẩn đoán bằng hai phƣơng pháp đang đƣợc ứng dụng rộng rãi hiện nay là phƣơng pháp RT-PCR và Realtime RT-PCR. Từ kết quả có đƣợc chúng tơi sẽ so sánh để tìm ra phƣơng pháp tối ƣu ứng dụng trong chẩn đoán EVs. Phƣơng pháp RT-PCR
Từ cơng trình nghiên cứu của Romero JR và Rotbart HA và cộng sự [37] chúng tôi sử dụng cặp mồi MD 90 và MD 91 để khuếch đại đoạn gen có kích thƣớc 154 bp nằm trong vùng 5’ không dịch mã. Phản ứng sử dụng bộ kit Onestep RT- PCR kit của Qiagen với các thành phần sau (mỗi phản ứng có tổng thể tích 25 µl):
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng RT-PCR chẩn đoán EVs
Thành phần Thể tích (µl)
H2O
QIAGEN Onestep RT-PCR Buffer, 5x MgCl2
dNTP mix (10mM mỗi loại) MD 90 (10 ρmol)
MD 91 (10 ρmol)
QIAGEN Onestep RT-PCR Enzym mix RNA khuôn 9,5 5,0 1,5 0,5 1,0 1,0 0,5 5,0 Tổng thể tích 25
Hỗn hợp phản ứng đƣợc voltex nhẹ, spindown rồi đƣa vào máy PCR ABI 9700 chạy với chu trình nhiệt nhƣ sau:
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR chẩn đốn EVs
Bƣớc Nhiệt độ (to) Thời gian (phút) Số chu kỳ
1 50 30 1 2 95 10 1 3 95 1 30 4 60 1 5 72 1 6 72 7 1
Sản phẩm RT-PCR sau đó đƣợc điện di trên gel agarose 1,5%, đệm TBE 1x trong 30 phút và sử dụng thang điện di 100bp
Đọc kết quả: Các mẫu có băng cùng kích thƣớc với mẫu chứng dƣơng đƣợc cho là dƣơng tính. Các mẫu có băng khác kích thƣớc hay khơng có băng đƣợc cho là âm tính
Phƣơng pháp realtime RT-PCR
Ứng dụng kỹ thuật realtime RT-PCR trong việc chẩn đốn EVs để khuếch đại đoạn gen có kích thƣớc 110bp trên vùng gen 5'UTR sử dụng cặp mồi EV-VP0- F, EV-VP0-R và đầu dò EV-VP0-probe-FAM [46]sử dụng kít Quantitect® Probe RT-PCR kit. Mỗi phản ứng (25 µl) bao gồm những thành phần sau đây:
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng Realtime RT-PCR chẩn đoán EVs
Thành phần Thể tích (µl)
H2O cất khử trùng, khử ion
Quantitect probe RT-PCR master mix (2x) VPO-F (10 ρmol)
VPO-R (10 ρmol) VPO-P (10 ρmol)
Quantitect probe RT-PCR Enzyme mix RNA khuôn 3,75 12,5 1,50 1,50 0,50 0,25 5,00 Tổng thể tích 25,0
Hỗn hợp các thành phần hóa chất trên đƣợc voltex nhẹ, spindown rồi đƣa vào máy Realtime PCR BioRad iQ5 chạy với chu trình nhiệt nhƣ sau:
Bảng 2.6: Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR chẩn đoán EVs Bƣớc Nhiệt độ (toC) Thời gian Số chu kỳ
1 46 30 phút 1
2 95 15 phút 1
3 95 15 giây
45
4 58 1 phút
Đọc kết quả: Các mẫu có Ct nhỏ hơn 40 đƣợc cho là dƣơng tính
Một số mẫu dƣơng tính đƣợc định lƣợng dựa trên dãy pha lỗng đã biết trƣớc nồng độ từ đại học Gothenburg - Thụy điển. Dãy pha lỗng có nồng độ nhƣ sau:
Chuẩn S1 S2 S3 S4
2.3.4.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán EV71 Phƣơng pháp RT-PCR
Từ cơng trình nghiên cứu của Phan Van Tu và cộng sự [36] chúng tơi tiến hành nhân dịng đoạn gen đích VP1 với cặp mồi MAS01 và MAS2A sử dụng kít QIAGEN Onestep RT-PCR bằng phƣơng pháp RT-PCR. Mỗi phản ứng PCR (25µl) bao gồm những thành phần sau đây:
Bảng 2.7: Thành phần phản ứng RT-PCR chẩn đốn EV71
Thành phần Thể tích (µl)
H2O
QIAGEN Onestep RT-PCR Buffer, 5x MgCl2
dNTP mix (10mM mỗi loại) MAS01 (10 ρmol)
MAS2A (10 ρmol)
QIAGEN Onestep RT-PCR Enzym mix RNA khuôn 9,5 5,0 1,5 0,5 1,0 1,0 0,5 5,0 Tổng thể tích 25
Hỗn hợp PCR đƣợc trộn đều và đặt vào máy PCR ABI 9700. Chu trình nhiệt đƣợc điều chỉnh về nhiệt độ, thời gian ủ và thời gian kéo dài sao cho phù hợp.
Bảng 2.8: Chu trình nhiệt cho phản úng RT-PCR EV71 Bƣớc Nhiệt độ (toC) Thời gian Số chu kỳ
1 50 30 phút 1 2 95 10 phút 1 3 95 30 giây 35 4 57 45 giây 5 72 45 giây 6 72 7 phút 1
Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1,5% trong đệm TBE 1x trong 30 phút và sử dụng thang điện di 100bp
Đọc kết quả: Các mẫu có băng đích cùng kích thƣớc với mẫu chứng dƣơng đƣợc cho là dƣơng tính. Các mẫu có băng đích khơng cùng kích thƣớc hay khơng có băng đích đƣợc cho là âm tính
Ứng dụng phƣơng pháp Realtime RT-PCR
Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR trong việc chẩn đoán EV71sử dụng cặp mồi EV71-VP1-634F và EV71-VP1-743R và đầu dò EV71-VP1-TaqMan [43] trong vùng gen VP1 sử dụng kít Quantitect® Probe RT-PCR kit. Mỗi phản ứng (25 µl) bao gồm những thành phần sau đây:
Bảng2.9: Thành phần phản ứng Realtime RT-PCR chẩn đán EV71
Thành phần Thể tích (µl)
H2O cất khử trùng, khử ion
Quantitect probe RT-PCR master mix (2x) EV71-VP1-634F (10 ρmol)
EV71-VP1-743R (10 ρmol) EV71-VP1-TaqMan(10 ρmol)
Quantitect probe RT-PCR Enzyme mix RNA khuôn 3,75 12,5 1,50 1,50 0,50 0,25 5,00 Tổng thể tích 25,0
Hỗn hợp các thành phần hóa chất trên đƣợc voltex nhẹ, spindown rồi đƣa vào máy Realtime PCR BioRad iQ5 chạy với chu trình nhiệt nhƣ sau:
Bảng 2.10 : Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR chẩn đoán EV71 Bƣớc Nhiệt độ (toC) Thời gian Số chu kỳ
1 46 30 phút 1
2 95 15 phút 1
3 95 15 giây
45
Đọc kết quả: Các mẫu có Ct nhỏ hơn 40 đƣợc cho là dƣơng tính. 2.3.4.4. Phƣơng pháp điện di
Nguyên lý: Điện di là một kỹ thuật đƣợc sử dụng trong phịng thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện. Trong phịng thí nghiệm sinh học phân tử ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp điện di để tách ly các phân tử DNA tổng số, các đoạn DNA cắt giới hạn, các sản phẩm PCR. DNA là một phân tử tích điện âm và di chuyển do dòng điện chạy qua bản gel agarose từ cực âm sang cực dƣơng. Trên cùng một bản gel, trong cùng một điện trƣờng, các phân tử DNA khác nhau về kích thƣớc, khối lƣợng và do đó sẽ khác nhau về điện tích sẽ di chuyển đƣợc quãng đƣờng khác nhau trong cùng một thời gian cho dòng điện chạy qua gel. Sau khi nhuộm ethidium bromide ngƣời ta sẽ phân biệt các DNA có khối lƣợng khác nhau trên cùng một bản gel. Qua đó có thể so sánh DNA đang cần phân tích với các mẫu DNA chuẩn đƣợc biết trƣớc khối lƣợng phân tử hoặc phân tách đƣợc các phân tử DNA có khối lƣợng khác nhau.
Các bƣớc tiến hành:
Cân 1,5g agarose cho vào trong 100ml đệm TBE 1x
Để ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút rồi đƣa vào lị vi sóng đun cho tan hồn tồn
Làm nguội gel đến khoảng 60oC, thêm 5 µl Redsafe lắc đều rồi đổ gel ra khay và lắp lƣợc
Khi gel nguội, tháo lƣợc, cho khuôn gel vào bể điện di, đổ đệm TBE 1x vào bể điện di sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2-5mm
Trộn sản phẩm PCR và loading dye rồi cho vào các giếng trên gel agarose Cắm điện cực và điện di DNA trong 30 phút ở 100V