CHƢƠNG III : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. TỶ LỆ DƢƠNG TÍNH EV ĐƢỢC CHẨN ĐỐN BẰNG PHƢƠNG PHÁP
SINH HỌC PHÂN TỬ
3.1.1. Tỷ lệ dƣơng tính EVs chẩn đốn theo phƣơng pháp RT-PCR
Đoạn gen đích có kích thƣớc 154bp trong vùng 5’UTR của EVsđã đƣợc nhân dịng thành cơng bằng phƣơng pháp RT-PCRsử dụng cặp mồi MD 90 và MD 91 [37], chứng dƣơng là chủng nuôi cấy từ đại học Gothenburg -Thụy Điển và chứng âm là nƣớc từ kit thƣơng mại Qiagen quantitect probe RT-PCR. Kết quả điện di sản phẩm sau phản ứng RT-PCR đƣợc thể hiện ở Hình 3.1:
Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR chẩn đoán EVs 1, 2, 3, 4, 5: Mẫu bệnh phẩm
N: Mẫu chứng âm P: Mẫu chứng dƣơng
M: Thang chuẩn DNA 100bp
Trên Hình 3.1cho thấy sản phẩm RT-PCR chẩn đoán EVs cùng với thang chuẩn 100bp sau khi đƣợc điện di trên gel agarose 1,5% trong thời gian 30 phút. Trong đó ở vị trí P là chứng dƣơng xuất hiện một băng duy nhất có kích thƣớc 154bp, ở vị trí N là mẫu chứng âm khơng xuất hiện băng nào. Vị trí giếng số 2, 4, 5 cùng xuất hiện một băng duy nhất có kích thƣớc trùng với mẫu chứng dƣơng ở vị trí 154bp. Do vậy, chúng tôi kết luận mẫu bệnh phẩm 2, 4, 5 dƣơng tính với EVs.
Ngƣợc lại, mẫu số 1, 3 không xuất hiện bất kỳ băng nào đƣợc chúng tơi kết luận là âm tính với EVs.
Sử dụng phƣơng pháp RT-PCR chẩn đoán EVs trên 255 bệnh nhân với 305bệnh phẩm, trong đó 10 bệnh nhân có 4 loại bệnh phẩm (dịch tỵ hầu, dịch nội khí quản, phân, dịch não tủy), 20 bệnh nhân có dịch ngốy họng và phân, 225 bệnh nhân chỉ có 1 loại bệnh phẩm (187 bệnh nhân chỉ có dịch họng, 30 bệnh nhân chỉ có mẫu phân, 5 bệnh nhân chỉ có nội khí quản, 2 bệnh nhân chỉ có dịch tỵ hầu và 1 bệnh nhân chỉ có dịch não tủy) thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
82/255 (32,2%) bệnh nhân dƣơng tính với EVsvà 173/255 (67,8%) âm tính. 93/305(30,5%) bệnh phẩm (72 dịch họng, 3 dịch tỵ hầu, 2 nội khí quản và 16 phân)dƣơng tính với EVsvà 212/305 (69,5%)âm tính với EVs. Chúng tơikhơng phát hiện đƣợc mẫu dịch não tủy nào dƣơng tính với EVs. Trong đó, 2 bệnh nhân có mẫu dịch tỵ hầu, phân, dịch nội khí quản cùng dƣơng tính, 6 bệnh nhân có dịch họng và phân cùng dƣơng tính, 66 bệnh nhân chỉ dƣơng tính với dịch họng, 8 bệnh nhân chỉ có phân dƣơng tính và 1 bệnh nhân chỉ có mẫu dịch tỵ hầu dƣơng tính.
Kết quả đƣợc minh họa Bảng 3.1 và Hình 3.2
Bảng 3.1: Tỷ lệ dƣơng tính EVs chẩn đốn đốn bằng phƣơng pháp RT-PCR
RT-PCR EV Dƣơng tính Âm tính
Bệnh nhân 82 (32,2%) 173 (67,8%) Bệnh phẩm 93 (30,5%) 212 (69,5%)
Hình 3.2: Tỷ lệ dƣơng tính EVs chẩn đốn đốn bằng phƣơng pháp RT-PCR 0 100 200 300 Bệnh nhân Bệnh phẩm 82 93 173 212 Dƣơng tính
Kết quả nghiên cứu của chúng tơi có tỷ lệ dƣơng tính EVs là 32,2%, tƣơng đƣơng với kết quả nghiên cứu của tác giả Noordhoek GT trên 186 bệnh nhân có tỷ lệ dƣơng tính EVs33,3% [28] và tác giảRomero JR và cộng sự năm 1998 trên 66 bệnh nhân có tỷ lệ dƣơng tính EVs trên cùng cặp mồi đƣợc chúng tôi sử dụng là 34,8% [37].
3.1.2. Tỷ lệ EVsdƣơng tính chẩn đốn theo phƣơng pháp realtime RT-PCR
Áp dụng kỹ thuật realtime RT-PCR, sử dụng cặp mồi và phân tử phát tín hiệu huỳnh quang Taqman Probe đặc hiệu, chúng tôi đã khuếch đại thành cơng đoạn gen đích có kích thƣớc 110bp.Chứng dƣơng là RNA đƣợc tách chiết từ chủng chuẩn nuôi cấy từ đại học Gothenburg -Thụy Điển và chứng âm là mẫu nƣớc trong kit thƣơng mại Quantitect probe RT-PCR đã thu đƣợc kết quả nhƣ Hình 3.3 sau:
Hình 3.3: Kết quả Realtime RT-PCR chẩn đốn EVs EV1, EV2, EV3, EV4, EV5, EV6, EV7: Mẫu bệnh phẩm
NC-EV: chứng âm PC-EV: chứng dƣơng
Hình 3.3 cho thấy chứng dƣơng PC-EV có tín hiệu huỳnh quang hình sin vƣợt qua tín hiệu nền ở chu kỳ 27,84 hiển thị trên máy tính.Các mẫu EV1, EV5, EV6, EV7 có tín hiệu tƣơng tự nhƣ mẫu chứng dƣơng vƣợt qua tín hiệu nền ở chu kỳ 28,1; 31,23; 28,51 và 28,29 nên đƣợc xem là mẫu dƣơng tính với EVs. Mẫu EV2, EV3, EV4 có tín hiệu huỳnh quang thấp hơn tín hiệu nền, giống với chứng âm đƣợc xem là mẫu âm tính với EVs. Nhƣ vậy chúng tôi đã ứng dụng thành công phƣơng pháp realtime RT-PCR trong chẩn đốn EVs và kết quả chúng tơi thu đƣợc nhƣ sau:
86/255(33,7%) bệnh nhân dƣơng tính với EVsvà 169/255 (66,3%) bệnh nhân âm tính với EVs. 100/305 (32,8%) bệnh phẩm dƣơng tính với EVs và 205/305 (67,2%) bệnh phẩm âm tính với EVs. Đặc biệt chúng tôi phát hiện thêm đƣợc 1 bệnh nhân có bệnh phẩm là dịch não tủy dƣơng tính với EVs.
Kết quả đƣợc minh họa Bảng 3.2 và Hình 3.4
Bảng 3.2: Tỷ lệ dƣơng tính EV chẩn đốn bằng phƣơng pháp realtime RT-PCR
Realtime RT-PCR Dƣơng tính Âm tính
Bệnh nhân 86 (33,7%) 169 (69,3%)
Bệnh phẩm 100 (32,8%) 205 (67,2%)
Hình 3.4: Tỷ lệ dƣơng tính EVs chẩn đốn bằng phƣơng pháp realtime RT-PCR 0 100 200 300 Bệnh nhân Bệnh phẩm 86 100 169 205 Dƣơng tính Âm tính
Nhƣ vậy, kết quả của chúng tơi (33,7%) có tỷ lệ dƣơng tính thấp hơn so với kết quả của tác giả Noordhoek GT trên 186 bệnh nhân bằng kỹ thuật realtime RT- PCR có tỷ lệ dƣơng tính với EVs là 48,4% [28].
Kết quả chẩn đoán EVs của tác giả Tran Tan Thanh và cộng sự bằng phƣơng pháp realtime RT-PCR trong nghiên cứu trên 112 bệnh nhân có tỷ lệ dƣơng tính với EVslà 68,8% [40]. Vậy nghiên cứu của chúng tơi có tỷ lệ dƣơng tính thấp hơn.
Kết quả nghiên cứu của tác giả Wei Li và cộng sự ở Hangzhou, Trung Quốc cho thấytỷ lệ dƣơng tính với EVsnăm 2010 là 37,28%, năm 2011là 19,66%. Nhƣ vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tơi có tỷ lệ dƣơng tính với EVs tƣơng đƣơng với kết quả nghiên cứu năm 2010 nhƣng lại cao hơn năm 2011[48].
Chúng tơi sử dụng các mẫu bệnh phẩm dƣơng tính với EVs đƣợc chẩn đoán bằng kỹ thuật realtime RT-PCR để tiếp tục chẩn đoán EV71.