CHƢƠNG III : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2. TỶ LỆ DƢƠNG TÍNH EV71 CHẨN ĐỐN THEO PHƢƠNG PHÁP SINH
3.2.2. Tỷ lệ dƣơng tính EV71 chẩn đốn theo phƣơng pháp realtime RT-PCR
Ứng dụng kỹ thuật realtime RT-PCR chúng tôi khuếch đại thành cơng đoạn gen đích trên gen VP1với cặp mồi và phân tử Taqman Probe đặc hiệu (EV71-VP1- 634F, EV71-VP1-743R, EV71-VP1-TaqMan), chứng dƣơng là RNA đƣợc tách chiết từ chủng chuẩn nuôi cấy từ đại học Gothernburg -Thụy Điển, chứng âm là nƣớc lấy từ kit thƣơng mại Qiagen quantitect probe RT-PCR kết quả minh họa trong Hình 3.7 sau: 0 45 90 Bệnh nhân Bệnh phẩm 8 13 78 87 Dƣơng tính Âm tính
Hình 3.7: Kết quả realtime RT-PCR chẩn đốn EV71
EV71-1, EV71-2, EV71-3, EV71-4 : mẫu bệnh phẩm NC-EV71: chứng âm
PC-EV71: chứng dƣơng
Trên Hình 3.7 cho thấy mẫu chứng dƣơng có tín hiệu huỳnh quang hình sin vƣợt qua tín hiệu nền ở chu kỳ 22,3. Các mẫu EV71-1, EV71-4 có tín hiệu tƣơng tự với mẫu chứng dƣơng PC-EV71 nên là mẫu dƣơng tính với EV71 ở chu kỳ 19,1 và 34,2. Mẫu EV71-2, EV71-3 có tín hiệu huỳnh quang thấp khơng vƣợt qua tín hiệu nền giống với chứng âm NC-EV71 nên là mẫu âm tính với EV71. Nhƣ vậy, chúng tơi đã ứng dụng thành công phƣơng pháp realtime RT-PCR trong chẩn đốn EV71. Chúng tơi tiếp tục sử dụng phƣơng pháp này để chẩn đoán 86 bệnh nhân và 100 bệnh phẩm đã dƣơng tính với EV. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
12 bệnh nhân dƣơng tính với EV71 chiếm 14% và 74 bệnh nhân âm tính với EV71 chiếm 86%. 19 bệnh phẩm dƣơng tính với EV71 chiếm 19% và 81 bệnh phẩm âm tính với EV71 chiếm 81%.
Bảng 3.4: Tỷ lệ dƣơng tính EV71 chẩn đốn bằng phƣơng pháp realtime RT-PCR
Realtime RT-PCR Dƣơng tính Âm tính
Bệnh nhân 12 (14%) 74 (86%)
Bệnh phẩm 19 (19%) 81 (81%)
Hình 3.8: Tỷ lệ dƣơng tính EV71 chẩn đốn bằng phƣơng pháp realtime RT-PCR Chúng tơi so sánh kết quả của mình với tác giả Tran Tan Thanh và cộng sự trên 112 bệnh nhân dƣơng tính EVs có tỷ lệ dƣơng tính EV71 là 6,3% [42]. Nhƣ vậy, kết quả của chúng tơi có tỷ lệ dƣơng tính EV71 cao hơn so với tác giả này .
Theo một nghiên cứu của tác giả Yi-hong Xie ở Guang - Xi, Trung Quốc. Tỷ lệ dƣơng tính EV71 trong 3 năm 2008, 2009, 2010 lần lƣợt là: 38,8%; 15,5% và 71,3% [52]. Nhƣ vậy, kết quả của chúng tơi có tỷ lệ dƣơng tính thấp hơn so với tác giả.
Kết quả nghiên cứu của tác giả Wei Li có tỷ lệ dƣơng tính EV71 trong năm 2010 là 25%, năm 2011 là 20% [48]. Nhƣ vậy kết quả của tác giả Wei Li có tỷ lệ dƣơng tính cao hơn của chúng tơi.
3.3. So sánh tỷ lệ dƣơng tính EVs và EV71 đƣợc chẩn đốn bằng hai phƣơng pháp RT-PCR và realtime RT-PCR
Tiến hành so sánh kết quả chẩn đoán EVs bằng phƣơng pháp RT-PCR và 0 45 90 Bệnh nhân Bệnh phẩm 12 19 74 81 Dƣơng tính Âm tính
Ngồi 82 (32,2%) bệnh nhân dƣơng tính với EVs chẩn đoán bằng phƣơng pháp RT-PCR, chúng tơi phát hiện thêm 4 bệnh nhân khác dƣơng tính với EVschẩn đoán bằng kỹ thuật realtime RT-PCR. Nhƣ vây, tỷ lệ dƣơng tính bằng kỹ thuật realtime RT-PCR là 33,7%, tăng 1,5% so với phƣơng pháp RT-PCR.
Ngồi 93 bệnh phẩm dƣơng tính với EVs bằng phƣơng pháp RT-PCR, phát hiện thêm 7 bệnh phẩm khác dƣơng tính với EVs bằng kỹ thuật realtime RT-PCR. Trong đó, 1 bệnh nhân dƣơng tính với cả phân và dịch não tủy, 2 bệnh nhân dƣơng tính với cả dịch họng và phân, 1 bệnh nhân dƣơng tính với dịch họng. Nhƣ vậy tỷ lệ dƣơng tính EVs chẩn đốn bằng kỹ thuật realtime RT-PCR là 32,8%, tăng 2,3% so với phƣơng pháp RT-PCR. Kết quả minh họa ở Bảng 3.5 sau:
Bảng 3.5: So sánh kết quả chẩn đoán EVs bằng hai phƣơng pháp RT-PCR và realtime RT-PCR
Bệnh nhân Bệnh phẩm
Phƣơng pháp Dƣơng tính Âm tính Dƣơng tính Âm tính RT-PCR 82 (32,2%) 173 (67,8%) 93 (30,5%) 212 (69,5%)
Realtime RT-PCR 86 (33,7%) 169 (66,3%) 100 (32,8%) 205 (67,2%)
Những bệnh nhân và bệnh phẩm đƣợc phát hiện thêm bằng kỹ thuật realtime RT-PCR đƣợc phát hiện ở chu kỳ 35, 36, 37,38. Trong khi kỹ thuật RT-PCR đƣợc giới hạn trong 35 chu kỳ. Những mẫu phát hiện thêm tiếp tục chúng tôi tiến hành xác định nồng độ dựa vào một dãy chuẩn pha loãng đã biết trƣớc nồng độ từ 25000 copies/ml tới 1600000 copies/ml của đại học Gothenburg - Thụy Điển. Các chỉ số đảm bảo kết quả của phản ứng realtime RT-PCR là: hệ số tƣơng quan R2= 0,992, độ cong: -3,366, hiệu suất phản ứng: 98,2%. Nhƣ vậy các chỉ số đều nằm trong khoảng cho phép của một phản ứng realtime Rt-PCR. Kết quả chúng tôi thu đƣợc ở Bảng 3.6 và Hình 3.9 sau:
Bảng 3.6: Nồng độ EVs các mẫu phát hiện thêm bằng kỹ thuật realtime RT-PCR
Bệnh nhân 1 2 3 4
Bệnh phẩm Dịch não tủy Phân Dịch họng Phân Dịch họng Phân Dịch họng
Chu kỳ phát hiện 37 35 36 38 37 35 36
Nồng độ
(x103 copies/ml)
5 20 10 2.5 5 20 10
Hình 3.9: Đồ thị phản ứng realtime RT-PCR đo nồng độ EVs
Tƣơng tự với EVs, chúng tơi tiến hành so sánh kết quả chẩn đốn EV71 bằng phƣơng pháp RT-PCR và realtime RT-PCR kết quả nhƣ sau:
Ngoài 8 bệnh nhân dƣơng tính EV71 chiếm 9,3%chẩn đoán bằng phƣơng pháp RT-PCR, chúng tôi xác định đƣợc thêm 4 bệnh nhân khác dƣơng tính với EV71 bằng phƣơng pháp realtime RT-PCR. Nhƣ vậy, tỷ lệ dƣơng tính với EV71 chẩn đốn bằng kỹ thuật realtime RT-PCRlà 14%, tăng 4,7%so với chẩn đoán bằng phƣơng pháp RT-PCR.
Ngoài 13 bệnh phẩm dƣơng tính với EV71 chiếm 13% chẩn đoán bằng phƣơng pháp RT-PCR, chúng tơi xác định thêm 6 bệnh phẩm khácdƣơng tính với EV71 bằng phƣơng pháp realtime RT-PCR. Trong đó, 2 bệnh nhân dƣơng tính với
cả dịch họng và phân, 1 bệnh nhân dƣơng tính vớidịch họng và 1 bệnh nhân dƣơng tính với phân. Nhƣ vậy, tỷ lệ dƣơng tính với EV71 là 19%, tăng 6%so với chẩn đoán bằng phƣơng pháp RT-PCR. Kết quả minh họa ở Bảng 3.7 sau:
Bảng 3.7: So sánh kết quả chẩn đoán EV71 bằng hai kỹ thuật RT-PCR và realtime RT-PCR
Bệnh nhân Bệnh phẩm
Phƣơng pháp Dƣơng tính Âm tính Dƣơng tính Âm tính RT-PCR 8 (9,3%) 78 (90,7%) 13 (13%) 87 (87%)
Realtime RT-PCR 12 (14%) 74 (86%) 19 (19%) 81 (81%) Chúng tôi thống kê các mẫu đƣợc phát hiện thêm thì thấy rằng các mẫu này có chu kỳ phát hiện từ 35, 36, 37, 38. Kết quả đƣợc minh họa ở Bảng 3.8 sau
Bảng 3.8. Chu kỳ ngƣỡng các mẫu dƣơng tính EV71 phát hiện thêm bằng kỹ thuật realtime RT-PCR
Bệnh nhân 1 2 3 4
Bệnh phẩm Phân Dịch họng Phân Dịch họng Phân Dịch họng
Chu kỳ phát hiện 36 35 36 37 36 38
Nhƣ vậy, kết quả chẩn đoán EVs và EV71 bằng phƣơng pháp realtime RT- PCR trên bệnh nhân có tỷ lệ 33,7% và 14% đều cao hơn kết quả chẩn đoán bằng phƣơng pháp RT-PCRlà 32,2% và 9,3%. Kết quảnày của chúng tơi cũng hồn tồn phù hợp với kết quả của tác giả Noordhoek GT[28]. Theo tác giả này, realtime RT- PCR là phƣơng pháp có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn do đƣợc sử dụng cặp mồi đặc hiệu và 1 phân tử Probe gắn huỳnh quang bổ sung với sợi DNA đích thay vì chỉ có một cặp mồi đặc hiệu của phƣơng pháp RT-PCR. Thêm vào đó, realtime RT-PCR là phƣơng pháp dễ dàng tiến hành, thời gian cho kết quả nhanh hơn và hạn chế đƣợc nhiễm chéo giữa các mẫu bệnh phẩm do không cần phải điện di và thực hiện nhiều thao tác đóng mở lắp ống nhƣ phƣơng pháp RT-PCR cổ điển. Kết quả của phƣơng pháp realtime RT-PCR đƣợc đọc trên máy tính tránh đƣợc nhầm lẫn, sai sót rất
tôi đã áp dụng phƣơng pháp này để phục vụ cho các chẩn đoán EVs và EV71 sau này.
3.4. TỶ LỆ PHÂN BỐ EVs VÀ EV71 THEO GIỚI TÍNH 3.4.1. Tỷ lệ phân bố EVs theo giới tính