Chƣơng 1 TỔNG QUAN
1.2.5. Một số gen chỉ thị dùng trong chuyển gen ở vi nấm
Gen chỉ thị mã hóa các protein tƣơng ứng đƣợc sử dụng trong đánh giá hiệu quả chuyển gen hoặc dùng nhƣ dấu hiệu để sàng lọc các thể chuyển gen. Sự có mặt của gen chỉ thị khiến các tế bào/khuẩn lạc của thể chuyển gen có kiểu hình khác biệt và dễ dàng phân biệt với các chủng tự nhiên. Gen chỉ thị không gây ảnh hƣởng đến chức năng sinh lý cũng nhƣ sinh trƣởng của các thể chuyển gen [33].
Ngƣợc lại với marker chọn lọc bảo vệ thể chuyển gen trên môi trƣờng chọn chọn lọc và gây chết hoặc ngăn chặn sự phát triển của chủng tự nhiên, gen chỉ thị đƣợc sử dụng để sàng lọc các chủng chuyển gen làm cho các tế bào/khuẩn lạc chứa gen chỉ thị có đặc điểm có thể quan sát trực quan bằng mắt. Các gen chỉ thị có thể đƣợc gắn liền với gen đích và đƣợc điều khiển dƣới cùng một promoter hoặc biểu hiện độc lập mà khơng có gen đích đi kèm. Một số các gen chỉ thị hay đƣợc sử dụng nhƣ: GFP, DsRed, GUS, lacZ…[40, 69, 72]. Các gen chỉ thị đƣợc dùng phổ biến
trong chuyển gen ở nấm sợi là gen mã hóa protein huỳnh quang xanh GFP và gen
mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed.
1.2.5.1. Gen mã hóa huỳnh quang xanh (GFP)
Gen GFP có chiều dài 720 bp đƣợc phân lập lần đầu tiên từ sứa
Aequoreavictoria bởi Osamu Shimomura năm 1962. GFP mã hóa protein có kích
thƣớc 238 axit amin (26,9 kDa). Protein này phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh lá cây khi tiếp xúc với ánh sáng bƣớc sóng 509 nm (Hình 1.5) [78, 89].
Trong lĩnh vực sinh học phân tử, gen GFP thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ một
gen chỉ thị trong chuyển gen và biểu hiện gen. GFP thƣờng đƣợc đƣa vào tế bào thông qua các kỹ thuật chuyển gen và sự tích hợp của GFP trong hệ gen của tế bào
có thể đủ bền vững qua các thế hệ sau. Đến nay, GFP đã đƣợc biểu hiện ở nhiều loài, bao gồm cả sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn, trong đó có nấm sợi [52].
Hình 1.5. Biểu hiện gen GFP ở nấm sợi Aspergillus fumigatus [35]
Gen huỳnh quang GFP rất hữu ích trong việc nghiên cứu xác định vị trí của protein hoặc kiểm tra mức độ biểu hiện của một gen mong muốn. Trong nghiên cứu phát triển các phƣơng pháp chuyển gen, biểu hiện gen chỉ thị GFP đã đƣợc chứng minh là thành công trên nhiều loài nấm sợi nhƣ Aspergillus fumigatus [35],
Aspergillus oryzae [56], Aspergillus nidulans [5], Aspergillus niger [21], Fusarium oxysporum [48]…
1.2.5.2. Gen mã hóa huỳnh quang đỏ (DsRed)
Gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed có chiều dài 678 bp đƣợc phân lập từ một lồi san hơ thuộc chi Discosoma. Protein DsRed gồm 226 axit amin với kích thƣớc 28 kD, phát huỳnh quang màu đỏ và tín hiệu huỳnh quang mạnh nhất khi đƣợc quan sát dƣới ánh sáng bƣớc sóng 583 nm [3]. Do đặc tính tƣơng tự nhƣ gen huỳnh quang GFP nên DsRed cũng đƣợc sử dụng làm gen chỉ thị trong nghiên cứu ở nhiều loài sinh vật khác nhau. Riêng với nấm sợi, gen DsRed đƣợc biểu hiện thành công trên nhiều loài nhƣ Sordaria macrospora [15], Fusarium oxysporum
[70], Acremonium chrysogenum [32], Aspergillus fumigatus [44]… Các tế bào nhận đƣợc gen DsRed sẽ có màu đỏ dƣới kính hiển vi huỳnh quang với bƣớc sóng phù hợp (Hình 1.6).