Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.6. Chuyển gen vào nấm sợi A oryzae
2.2.6.1. Biến nạp vector nhị thể vào vi khuẩn A. tumefaciens AGL1
Vector đƣợc biến nạp vào chủng vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 bằng phƣơng pháp xung điện. Khuẩn lạc AGL1 đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng LB lỏng qua đêm, ở 28ºC. Dịch vi khuẩn đƣợc ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút ở 4ºC. Cặn chứa tế bào vi khuẩn đƣợc rửa 3 lần bằng HEPES 100 mM và 1 lần bằng glycerol 10% và hòa trong 1 ml glycerol 10%. Hỗn hợp chứa 40 µl dịch tế bào và 200 ng plasmid đƣợc chuyển vào cuvet 2 mm và đặt trên nƣớc đá. Biến nạp bằng xung điện sử dụng máy chuyển gen xung điện Bio-Rad với các thơng số của chƣơng trình là 2,5 kV; 400 Ω; 25 µF. Sau khi bắn xung điện, hỗn hợp đƣợc chuyển sang ống eppendorf 2 ml và bổ sung thêm 500 µl mơi trƣờng LB lỏng và lắc 1 giờ ở 28ºC. Thu tế bào vi khuẩn bằng ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút trong 20 giây, đổ bỏ dịch, hòa tế bào vào phần dịch còn lại và cấy trải trên môi trƣờng LB chứa kháng sinh kanamycin (100 mg/l). Đĩa nuôi cấy đƣợc ủ ở 28ºC trong 72 giờ để thu nhận các khuẩn lạc riêng rẽ. Các khuẩn lạc sau đó đƣợc kiểm tra bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen có mặt trong vector.
2.2.6.2. Chuyển cấu trúc xóa gen pyrG vào nấm sợi A. oryzae
Vector xóa gen pyrG sau khi chuyển vào vi khuẩn A. tumefaciens, sẽ đƣợc
chuyển vào chủng VS1 và RIB40, sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đƣợc mô tả bởi Mullins và cộng sự năm 2001 [68]. Khuẩn lạc tƣơi của vi khuẩn mang vector xóa gen đƣợc nuôi trên môi trƣờng LB lỏng trong 15-24 giờ ở 28ºC. Sau đó sử dụng 1 ml dịch ni bổ sung vào 9 ml mơi trƣờng IM lỏng có chứa 200 µM acetosyringone (AS), ni lắc 200 vịng/phút ở 28ºC khoảng 5-6 giờ cho đến khi OD600 đạt 0,6-0,8. Hỗn hợp chứa 100 µl bào tử (nồng độ 107 bào tử/ml) và 100 µl dịch vi khuẩn AGL1 đã cảm ứng đƣợc trải đều lên màng cellulose (mã số FT-3-303-085, Sartorius, Đức) đặt sẵn trên đĩa môi trƣờng cảm ứng IM có bổ sung 200 µM AS. Sau 60 giờ đồng ni cấy ở 22ºC, màng cellulose đƣợc chuyển sang đĩa mơi trƣờng chọn lọc có bổ sung 0,5% uridine; 0,2% uracil; 2
g/l 5-FOA và 300 mg/l kháng sinh cefotaxime. Môi trƣờng chọn lọc cho xóa gen
pyrG ở chủng VS1 là CD, và ở chủng RIB40 là PDA (0,4% dịch chiết khoai tây;
2% glucose; 1,6% agar). Đĩa môi trƣờng chọn lọc đƣợc đặt trong tối ở nhiệt độ 30ºC, sau 5-7 ngày sẽ thu đƣợc các thể xóa gen kháng 5-FOA.
Xác nhận các chủng xóa gen pyrG: Các khuẩn lạc nấm riêng rẽ thu đƣợc
trên môi trƣờng chọn lọc sẽ đƣợc thuần khiết bằng kỹ thuật ria 3 pha trên mơi trƣờng CD có bổ sung 5-FOA, uridine và uracil. Các khuẩn lạc đơn sau đó sẽ đƣợc kiểm tra khả năng sinh trƣởng trên các mơi trƣờng có hoặc khơng có uridine/uracil. Các chủng xóa gen đƣợc kiểm tra bằng PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho gen
pyrG (Bảng 2.2).
2.2.6.3. Chuyển gen biểu hiện GFP, DsRed, phyA vào nấm sợi A. oryzae trợ dưỡng uridine/uracil
Các vector nhị thể pEX1/pEX2/pEX3 đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 bằng phƣơng pháp xung điện. Chủng AGL1 mang vector biểu hiện sẽ đƣợc chuyển vào các chủng A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil. Các bƣớc
chuyển gen tƣơng tự nhƣ chuyển vector xóa gen pyrG đã đƣợc mô tả ở phần trên. Tuy nhiên do chuyển vào chủng trợ dƣỡng uridine/uracil nên trên môi trƣờng cảm ứng (IM+AS) cần bổ sung thêm 0,05% uridine và 0,05% uracil. Sau 60 giờ đồng nuôi cấy, màng cellulose đƣợc chuyển sang đĩa môi trƣờng chọn lọc M+Met có chứa kháng sinh cefotaxime (300 mg/l). Các khuẩn lạc nhận đƣợc gen sẽ có khả năng tự tổng hợp đƣợc uridine/uracil và sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc (môi trƣờng tối thiểu).
Xác nhận các chủng chuyển gen GFP và DsRed: Các thể chuyển gen GFP
và DsRed đƣợc thuần khiết và đƣợc sử dụng để tách chiết DNA hệ gen. Sự có mặt của GFP hoặc DsRed trong hệ gen vi nấm đƣợc kiểm tra bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen từng gen là GFP-F/GFP-R hoặc DsRed-F/DsRed-R. Bên cạnh đó, các chủng mang gen GFP và DsRed đƣợc xác nhận khả năng phát quang dƣới
Xác nhận các chủng chuyển gen phyA: Các chủng chuyển gen phyA đƣợc
cấy điểm trên mơi trƣờng PSM nhằm kích thích khả năng sinh enzyme phytase. Những khuẩn lạc có vịng phân giải phytate lớn sẽ đƣợc sử dụng để tách chiết DNA tổng số và việc chuyển gen phyA thành công xác nhận bằng PCR sử dụng cặp mồi phyA-F/phyA-R.