Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác nhận chủng A oryzae an toàn để sử dụng cho chuyển gen
3.1.1. Phân biệt các chủng A. oryzae an toàn và chủng Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin độc tố aflatoxin
Để phân biệt loài nấm sợi A. oryzae an toàn với loài A. flavus sinh độc tố, 2 chủng A. oryzae RIB40, VS1 và chủng A. flavus NRRL 3357 đƣợc nuôi trên đĩa môi trƣờng PDA ở 30ºC. Sau 3 ngày, quan sát hình thái khuẩn lạc của 2 lồi cho thấy sự tƣơng tự nhau với màu vàng-xanh của bào tử nấm. Dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 1200 lần, bào tử nấm đƣợc đính trên cuống mang bào tử có dạng bơng hoa cúc điển hình (Hình 3.1).
Hình 3.1. Hình thái A. oryzae và A. flavus trên đĩa môi trƣờng PDA và dƣới
kính hiển vi quang học
Hình thái của A. oryzae và A. flavus có thể thay đổi khi ni trên mơi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau và phƣơng thức sinh sản bằng hình thành bào tử là điển hình ở cả hai lồi. Các kết quả quan sát hình thái trong nghiên cứu này cũng giống với các nghiên cứu trƣớc đây cho thấy A. oryzae và A. flavus là tƣơng tự nhau về mặt
hình thái và nếu chỉ dựa trên hình thái sẽ khơng thể phân biệt chính xác hai lồi với nhau [8, 53, 60, 85].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đƣa ra một số phƣơng pháp đơn giản để phân biệt, nhận biết nấm mốc tƣơng A. oryzae với A. flavus sinh độc tố. Có hai
phƣơng pháp có thể đƣợc sử dụng để phân biệt hai loài nấm sợi này, gồm phƣơng pháp quan sát sự phát quang của độc tố aflatoxin trên đĩa môi trƣờng nuôi cấy và phƣơng pháp PCR các gen đặc hiệu liên quan đến quá trình sinh tổng hợp độc tố chỉ có ở lồi A. flavus. Hai chủng A. oryzae (RIB40 và VS1) và A. flavus NRRL 3357
đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thạch dừa (CAM), 5-7 ngày trong tối ở nhiệt độ 28ºC. Từ ngày thứ 5, sự phát quang của độc tố aflatoxin tiết ra mơi trƣờng có thể quan sát đƣợc bằng mắt dƣới ánh sáng cực tím UVA bƣớc sóng 365 nm. Quan sát đĩa nuôi cấy các chủng nấm nhận thấy A. flavus NRRL 3357 có vùng xung quanh
khuẩn lạc phát quang màu xanh lục (Hình 3.2A), trong khi đó các chủng A. oryzae RIB40, VS1 khơng phát quang (Hình 3.2B). Ánh sáng huỳnh quang xanh đƣợc cho là của độc tố aflatoxin tiết ra trong quá trình sinh trƣởng của A. flavus. Kết quả quan sát đƣợc tƣơng đồng với một số nghiên cứu trƣớc đây khi Sudini và Rodrigues quan sát thấy màu xanh lục của độc tố aflatoxin tiết ra xung quang khuẩn lạc A. flavus
[83, 92].
Hình 3.2. Kiểm tra sự phát quang của độc tố aflatoxin trên môi trƣờng CAM của
Nấm sợi A. flavus đƣợc chia thành hai nhóm A. flavus sinh độc tố và A. flavus không sinh độc tố. Các chủng A. flavus không sinh độc tố mất đi một số gen
liên quan đến quá trình sinh tổng hợp aflatoxin dẫn tới khơng cịn khả năng sinh độc tố này [80]. Phƣơng pháp quan sát độc tố dƣới ánh sáng UV đơn giản và nhanh chóng, tuy nhiên khả năng sinh aflatoxin giữa các chủng A. flavus có thể khác nhau tùy thuộc vào môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy. Một số chủng sinh độc tố với lƣợng nhỏ sẽ khó phát hiện đƣợc bằng quan sát trực tiếp. Để có đƣợc quy trình phân biệt chính xác hơn nấm sợi A. oryzae và A. flavus, chúng tôi tiến hành thử nghiệm các
phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi ITS1/ITS4, Aof-ITS-F/ITS4 và AFB-F/AFB-R trên đồng thời 5 chủng thuộc 5 loài khác nhau, bao gồm A. flavus NRRL 3357, A. oryzae RIB40, A. niger N402, A. nidulans FGSC A4 và A. fumigatus VTCCF 015.
Cặp mồi đa năng ITS1/ITS4 đƣợc sử dụng rộng rãi để khuếch đại vùng ITS của DNA ribosome ở hầu hết các loài nấm phân lập đƣợc từ tự nhiên [114]. Kích thƣớc của các đoạn ITS thu đƣợc vào khoảng 566-599 bp tùy thuộc lồi (Hình 3.3A). Dựa trên dữ liệu trình tự ITS từ Ngân hàng gen Quốc tế GenBank, hai loài A. oryzae và
A. flavus có kích thƣớc vùng ITS giống nhau là 595 bp, A. niger là 599 bp, A. nidulans là 566 bp và A. fumigatus là 597 bp. So sánh trình tự ITS của A. oryzae với A. flavus cho thấy hai trình tự giống hệt nhau (100%), do đó khơng thể sử dụng
trình tự ITS của DNA ribosome để phân biệt hai loài này.
Mồi Aof-ITS-F (dựa theo trình tự mồi AO-ITS-uni F trong nghiên cứu phân biệt A. flavus của Chiba và cộng sự năm 2014) đƣợc thiết kế dựa trên trình tự ITS1 đặc hiệu chỉ với A. oryzae và A. flavus [10]. Chúng tôi thử nghiệm kết hợp mồi Aof- ITS-F với mồi ITS4 để kiểm tra khả năng khuếch đại vùng ITS ở cả 5 loài
Aspergillus. Kết quả nhận thấy cặp mồi Aof-ITS-F/ITS4 chỉ gắn đặc hiệu với vùng
ITS của A. oryzae và A. flavus và cho sản phẩm PCR với kích thƣớc 486 bp, mà
không khuếch đại đƣợc vùng ITS của 3 lồi cịn lại là A. niger, A. nidulans và A. fumigatus (Hình 3.3B). Do đó, cặp mồi Aof-ITS-F/ITS4 có thể đƣợc sử dụng để
Aflatoxin là độc tố gây ung thƣ cho ngƣời và động vật và đƣợc tạo ra trong quá trình sinh trƣởng của A. flavus trên các nguồn nguyên liệu là ngũ cốc. Nhóm
gen liên quan đến sinh tổng hợp độc tố này có mặt ở cả genome của A. oryzae và A.
flavus. Tuy nhiên trải qua quá trình tiến hóa, nhóm gen này đã bị bất hoạt ở A. oryzae do trình tự của chúng đã tích lũy các đột biến điểm và bị đột biến mất đoạn.
Đó là lý do A. oryzae mặc dù có quan hệ mật thiết về mặt di truyền với A. flavus
nhƣng lại không tố sinh độc aflatoxin [8, 17, 80]. Cặp mồi AFB-F/AFB-R (đƣợc thiết kế để liên kết đặc hiệu tới trình tự nối giữa gen aflR và aflJ liên quan đến sinh tổng hợp aflatoxin ở A. flavus) đã khuếch đại đặc hiệu một đoạn trình tự 116 bp chỉ ở A. flavus (Hình 3.3C). Kết quả tƣơng tự cũng đã đƣợc Chiba và cộng sự công bố năm 2014 khi sử dụng cùng cặp mồi AFB-F/AFB-R để phân biệt A. oryzae và A. flavus [10].
Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm PCR phân biệt A. oryzae với A. flavus. A. Sử dụng
cặp mồi ITS1/ITS4. B. Sử dụng cặp mồi Aof-ITS1-F/ITS4. C. Sử dụng cặp mồi AFB-F/AFB-R. D. Multiplex PCR với 5 mồi kết hợp với marker 100 bp
Nhằm đơn giản quy trình phân biệt A. oryzae với A. flavus và giữa 2 loài này với các lồi Aspergillus khác, chúng tơi đã kết hợp cả 5 mồi ITS1, Aof-ITS-F, ITS4, AFB-F và AFB-R trong một phản ứng PCR duy nhất (multiplex PCR) để khuếch đại đồng thời các đoạn DNA đặc hiệu cho từng loài. Kết quả multiplex PCR với DNA từ 15 chủng nấm (10 chủng A. oryzae, 2 chủng A. flavus, 1 chủng A. niger, 1 chủng A. nidulans và 1 chủng A. fumigatus) cho thấy chỉ hai chủng A. flavus là có
đủ 3 băng DNA (595 bp, 486 bp, 116 bp), trong đó băng 116 bp đặc hiệu cho A. flavus. Các chủng A. oryzae (10 chủng) xuất hiện 2 băng (595 bp, 486 bp) giống với A. flavus. Trong khi đó 3 chủng đại diện cho 3 lồi Aspergillus cịn lại là A. niger
N402, A. nidulans FGSC A4 và A. fumigatus VTCCF 015 chỉ xuất hiện 1 băng duy nhất (566-599 bp) đặc trƣng cho vùng ITS của DNA ribosome đƣợc khuếch đại bởi cặp mồi ITS1/ITS4 (Hình 3.3D). Nhƣ vậy, sự kết hợp đồng thời của 5 mồi đặc hiệu cho trình tự ITS và cho trình tự gen liên quan đến sinh tổng hợp aflatoxin trong một phản ứng multiplex PCR duy nhất giúp phân biệt nhanh A. oryzae dùng trong sản
xuất thực phẩm với A. flavus sinh độc tố. Ngoài ra, sản phẩm PCR tạo thành từ cặp mồi đa năng ITS1/ITS4 đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng dƣơng để xác nhận chất lƣợng của DNA tách từ nấm là đủ tốt cho PCR.
3.1.2. Lựa chọn chủng A. oryzae phục vụ cho chuyển gen
Nhằm chủ động trong việc sử dụng chủng A. oryzae có nguồn gốc Việt Nam với đặc tính tốt dùng cho chuyển gen và nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp, chúng tôi lựa chọn chủng A. oryzae VS1 phân lập đƣợc từ vùng làm tƣơng truyền thống tại Việt Nam do Phịng Genomic, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym và Protein cung cấp. Dựa trên kết quả kiểm tra khả năng sinh độc tố aflatoxin trên mơi trƣờng CAM (Hình 3.2) và kết quả mutiplex PCR (Hình 3.3), chủng VS1 là an toàn đáp ứng yêu cầu về nghiên cứu chuyển gen của chúng tôi. Trên môi trƣờng PDA sau 3 ngày nuôi cấy ở 30ºC, chủng A. oryzae VS1 sinh
trƣởng nhanh hơn chủng chuẩn quốc tế RIB40 với đƣờng kính khuẩn lạc tƣơng ứng là 3,5 cm (VS1) và 3,0 cm (RIB40) (Hình 3.4A). Cả hai chủng đều cho thấy khả
năng phân giải tinh bột khá tốt với kích thƣớc vịng phân giải tƣơng đƣơng nhau (5- 7 mm) (Hình 3.4B).
Hình 3.4. Khả năng sinh trƣởng và tiết enzyme amylase của A. oryzae VS1 so với
chủng RIB40. A. Sinh trƣởng của hai chủng trên môi trƣờng PDA. B. Khả năng tiết enzyme amylase trên môi trƣờng CD+ 1% tinh bột.
Khả năng tiết mạnh enzyme ngoại bào trong đó có amylase của A. oryzae
cũng đã đƣợc công nhận trong một số các nghiên cứu trƣớc đây [98, 113]. Việc sử dụng các chủng A. oryzae nhƣ vậy để phục vụ chuyển gen biểu hiện protein/enzyme tái tổ hợp sẽ giúp giảm chi phí của q trình tách chiết và có tiềm năng ứng dụng vào thực tiễn sản xuất.