Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.5. Tạo các vectornhị thể dùng cho chuyển gen
PCR các đoạn DNA: Trình tự các đoạn DNA đƣợc lấy từ cơ sở dữ liệu của
ngân hàng GenBank, các cặp mồi khuếch đại gen hoặc DNA đƣợc thiết kế trên phần mềm Primer3 và đƣợc tổng hợp hóa học bởi cơng ty IDT. Các đoạn DNA đƣợc PCR từ DNA tổng số hoặc cDNA sử dụng enzyme Phusion® High-Fidelity DNA polymerase của hãng Thermo Scientific. Thành phần trong 25 µl hỗn hợp phản ứng nhƣ sau: buffer 5x HF 5 µl, enzyme Phusion DNA polymerase 1 µl, dNTP 1 µl, mồi xi 1 µl, mồi ngƣợc 1 µl, DNA khn 1 µl, nƣớc cất khử ion 15 µl. Chu trình nhiệt nhƣ sau: 94ºC (3 phút); 35 chu kỳ của 94ºC (30 giây), 50-60ºC (30 giây), 72ºC (30 giây đến 1 phút); 72ºC (7 phút). Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% sau đó đƣợc tinh sạch bằng kit tinh sạch DNA của hãng Promega hoặc Anabio R&D JSC theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Xử lý vector và đoạn DNA với enzyme giới hạn: Các vector và đoạn DNA
đƣợc cắt với enzyme giới hạn dạng FastDigest của hãng Thermo Scientific. Quy trình xử lý enzyme theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm xử lý enzyme giới hạn đƣợc điện di trên gel agarose 0,8%. Đoạn DNA trên gel đƣợc cắt và chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml. Quy trình tinh sạch đƣợc thực hiện với kit tinh sạch DNA thƣơng mại theo sự hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm sau tinh sạch đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
Nối đoạn DNA vào plasmid (ligation): Plasmid và đoạn DNA sau khi xử lý
enzyme giới hạn và tinh sạch đƣợc trộn với tỉ lệ 1:1 theo thể tích, sử dụng enzyme nối T4 DNA ligase của hãng Thermo Scientific. Các thành phần trong 20 µl hỗn hợp phản ứng nhƣ sau: T4 ligase buffer 10x 2 µl, enzyme T4 DNA ligase 1 µl, plasmid 4 µl, đoạn DNA 4 µl, nƣớc cất khử ion 9 µl. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 4ºC-10ºC qua đêm, sau đó đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α bằng phƣơng
pháp sốc nhiệt. Quá trình biến nạp nhƣ sau: ống chứa tế bào vi khuẩn E. coli DH5α đƣợc giữ trên nƣớc đá 5-10 phút cho tới khi rã đông. Hút hỗn hợp lai vào ống tế bào khả biến, trộn nhẹ bằng pipet và đặt trên đá 20 phút. Sau đó sốc nhiệt 40 giây ở 42ºC và đặt trên nƣớc đá 2 phút. Bổ sung 800 µl LB lỏng và ống đƣợc lắc 1 giờ ở 37ºC. Tế bào đƣợc thu bằng ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 20 giây và đƣợc trải trên đĩa môi trƣờng chọn lọc LB chứa kháng sinh kanamycin (100 mg/l). Đĩa đƣợc ủ ở 37ºC trong 24 giờ. Các khuẩn lạc nhận đƣợc từ đĩa chọn lọc đƣợc kiểm tra bằng colony-PCR (PCR từ khuẩn lạc) với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA. Phản ứng colony-PCR sử dụng GoTaq® Green Master Mix của hãng Promega. Những khuẩn lạc cho kết quả PCR đúng với kích thƣớc của đoạn chèn sẽ đƣợc sử dụng để tách chiết plasmid và cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn.
Tách plasmid: Khuẩn lạc chọn đƣợc cấy vào bình tam giác 100 ml chứa 10-
20 ml môi trƣờng LB lỏng (1% peptone; 0,5% cao nấm men; 0,5% NaCl) bổ sung thêm kháng sinh kanamycin (100 mg/l). Bình ni cấy đƣợc lắc qua đêm ở 30- 37ºC. Ly tâm 4 ml dịch ni ở 12000 vịng/phút trong 20 giây (ly tâm 2 lần, mỗi lần 2 ml). Bổ sung 250 µl buffer B1 (50 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 7,6) và 3 µl RNase (10 mg/ml). Cặn tế bào đƣợc hòa tan vào đệm bằng vortex. Bổ sung thêm 250 µl buffer B2 (200 mM NaOH, 1% SDS) sau đó đảo ống nhẹ nhàng 5 lần. Tiếp đó bổ sung thêm 350 µl buffer N3 (kali acetate 3M; pH 5,5) và đảo ống nhẹ 5 lần. Ly tâm ống ở 12000 vòng/phút ở 4ºC trong 20 phút. Hút khoảng 700 µl dịch trong có chứa plasmid chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml và bổ sung thêm 700 µl isopropanol lạnh. Ống đƣợc trộn đều bằng vortex đều và đƣợc ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 20 phút ở 4ºC. Đổ bỏ dịch trong và rửa cặn bằng 500 µl ethanol 70%. Ly tâm 5 phút và đổ bỏ dịch. Cặn chứa DNA đƣợc làm khô bằng máy cô quay chân khơng SpeedVac và hịa vào 50 µl đệm TE 1x. Plasmid đƣợc bảo quản ở ngăn đá tủ lạnh hoặc ở -30ºC.
Tạo vector xóa gen pyrG ở A. oryzae: Cấu trúc xóa gen pyrG ở A. oryzae đƣợc thiết kế nằm trong vùng T-DNA trên một vector nhị thể (binary vector), cấu
trúc này sẽ đƣợc đƣa vào A. oryzae bằng phƣơng pháp chuyển gen trung gian qua vi khuẩn A. tumefaciens. Vector xóa gen đƣợc tạo ra dựa trên khung của vector nhị thể pGreen2 [102]. Đoạn DNA dài 1,41 kb tƣơng ứng với vùng 5’ của gen pyrG (5’ pyrG: đoạn DNA phía trƣớc phần mã hóa) và đoạn DNA dài 1,33 kb tƣơng ứng
vùng 3’ của gen pyrG (3’ pyrG: đoạn DNA phía sau phần mã hóa) đƣợc khuếch đại bằng enzyme Phusion® High-Fidelity DNA polymerase sau đó đƣợc nối vào vector pGreen2. Cụ thể nhƣ sau: vector pGreen2 đƣợc xử lý bằng enzyme giới hạn
EcoRI/XhoI, điện di để loại bỏ đoạn 3,5 kb và đoạn khung vector (8,3 kb) đƣợc tinh
sạch để nối với đoạn DNA 5’pyrG cũng đã đƣợc cắt với cùng enzyme giới hạn
EcoRI/XhoI. Sau đó đoạn 3’ pyrG đƣợc nối vào vector tại trình tự cắt của enzyme XhoI/HindIII. Vector mới tạo chứa cả đoạn 5’ pyrG và 3’ pyrG liền kề nhau đƣợc xác nhận bằng PCR và bằng cắt enzyme giới hạn trƣớc khi biến nạp vào vi khuẩn A.
tumefaciens AGL1 sử dụng phƣơng pháp xung điện.
Tạo vector biểu hiện gen huỳnh quang xanh GFP: Vector biểu hiện gen
GFP với marker chọn lọc là gen trợ dƣỡng uridine/uracil (pyrG) đƣợc cải biến từ
vector pGreen2. Cấu trúc biểu hiện gen pyrG của A. oryzae dài 1,8 kb gồm trình tự promoter (vùng 5’ của gen), phần gen mã hóa và đoạn teminator (vùng 3’ của gen) đƣợc khuếch đại từ DNA tổng số của chủng A. oryzae RIB40. Gen pyrG đƣợc nối
vào vector pGreen2 tại vị trí của enzyme giới hạn EcoRI và SpeI để thay thế cấu
trúc biểu hiện gen kháng kháng sinh hygromycin (HPH). Vector nhị thể tạo thành đƣợc đặt tên là pEX1.
Tạo vector biểu hiện gen huỳnh quang đỏ DsRed: Gen mã hóa protein
huỳnh quang đỏ DsRed khuếch đại từ vector ppK2-DsRed do phịng thí nghiệm
Genomic cung cấp với cặp mồi đặc hiệu DsRed-F/DsRed-R. Sản phẩm thu đƣợc đƣợc tinh sạch và đƣợc nối vào vector pEX1 tại vị trí enzyme giới hạn XhoI và BamHI để thay thế cho gen GFP. Hai đầu của gen DsRed đƣợc bổ sung thêm trình
tự nhận biết của một số enzyme giới hạn (PmlI, AflII, EcoRV, SacI, SacII) để thuận lợi cho việc thay gen DsRed bằng gen mong muốn. Vector nhị thể thu đƣợc đặt tên là pEX2.