Xác nhận các thể chuyển gen

Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.4. Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen với gen huỳnh quang GFP và

3.4.2. Xác nhận các thể chuyển gen

3.4.2.1. Xác nhận các thể chuyển gen GFP

Các thể chuyển gen GFP đƣợc xác nhận bằng 2 phản ứng PCR độc lập, sử dụng các cặp mồi pyrG-orf-F/pyrG-orf-R và GFP-F/GFP-R (Bảng 2.2). Kết quả PCR 4 chủng VS1 chuyển gen đều thấy xuất hiện đoạn DNA với kích thƣớc của gen pyrG (900 bp) và GFP (720 bp) (Hình 3.17A, B). So sánh băng DNA khi PCR từ thể chuyển gen với băng DNA PCR từ vector pEX1, nhận thấy các băng có kích thƣớc bằng nhau. Bên cạnh việc xác nhận bằng PCR, các chủng chuyển gen còn đƣợc quan sát sự phát quang của protein GFP sử dụng kính hiển vi huỳnh quang. Sợi nấm và cuống sinh bào tử của cả 4 chủng chuyển gen đều phát tín hiệu huỳnh quang GFP khá tốt (Hình 3.17C). Từ các kết quả thu đƣợc, có thể kết luận gen GFP đã đƣợc biểu hiện thành công ở nấm A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil.

Hình 3.17. Biểu hiện gen huỳnh quang GFP ở chủng A. oryzae VS1 trợ dƣỡng

uridine/uracil. A. Kiểm tra bằng PCR gen pyrG. B. Kiểm tra bằng PCR gen GFP.

C. Sợi nấm và cấu trúc sinh bào tử của các thể chuyển gen dƣới kính hiển vi huỳnh

quang.

Chủng AUT1-PlD trợ dƣỡng và một chủng AUT1-PlD chuyển gen GFP

đƣợc nuôi trên đĩa mơi trƣờng M có bổ sung 0,1% uridine và 0,1% uracil. Sau 5 ngày sinh trƣởng ở 30ºC, chúng tôi nhận thấy chủng chuyển gen GFP (AUT1-PlD:: GFP) sinh trƣởng bình thƣờng với màu sắc và hình dạng khuẩn lạc tƣơng tự nhƣ chủng trợ trƣỡng AUT1-PlD (Hình 3.18A). PCR chủng chuyển gen sử dụng cặp mồi GFP-F/GFP-R thu đƣợc một băng GFP (720 bp). Trong khi đó, chủng đối

chứng (chủng trợ dƣỡng) không xuất hiện băng GFP (Hình 3.18B). Ngồi ra khi

quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang, hệ sợi và cuống mang bào tử của chủng chuyển gen phát tín hiệu huỳnh quang GFP chứng tỏ gen GFP đã đƣợc biểu hiện

Hình 3.18. Biểu hiện gen huỳnh quang GFP ở chủng A. oryzae AUT1-PlD trợ

dƣỡng uridine/uracil. A. Sự giống nhau về hình thái của chủng chuyển gen và không chuyển gen. B. PCR kiểm tra sự có mặt của gen GFP. C. Hình thái sợi nấm

của thể chuyển gen đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang.

3.4.2.1. Xác nhận các thể chuyển gen DsRed

Sự sinh trƣởng của 2 chủng VS1 chuyển gen DsRed (kí hiệu là R1 và R2)

đƣợc so sánh với chủng tự nhiên và chủng xóa pyrG trên mơi trƣờng CD và CD bổ sung 0,1% uridine; 0,1% uracil. Sau 3 ngày phát triển ở 30ºC, các chủng chuyển gen sinh trƣởng bình thƣờng trên mơi trƣờng tối thiểu (CD) với hình thái và màu sắc tƣơng tự chủng tự nhiên (Hình 3.19A). Các thể chuyển gen sinh trƣởng trên môi trƣờng tối thiểu không cần bổ sung uridine/uracil đồng nghĩa với việc chức năng gen pyrG trong các chủng này đã đƣợc phục hồi.

Hình 3.19. Chuyển gen vào chủng A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil. A. Xác

nhận các thể chuyển gen trên môi trƣờng chọn lọc (môi trƣờng tối thiểu Czapek- Dox). B. Xác nhận thể chuyển gen bằng PCR gen DsRed và pyrG, sử dụng chủng tự

nhiên và chủng xóa pyrG làm đối chứng. C. Cấu trúc mang bào tử của chủng chuyển gen R1 dƣới kính hiển vi huỳnh quang.

Sự có mặt của gen huỳnh quang DsRed và gen pyrG trong 2 chủng chuyển

gen đƣợc xác nhận bằng PCR sử dụng cặp mồi DsRed-F/DsRed-R và pyrG-orf- F/pyrG-orf-R (Bảng 2.2). Hai cặp mồi đƣợc PCR độc lập sau đó sản phẩm đƣợc trộn cùng và điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di cho thấy cả 2 chủng R1 và R2 đều xuất hiện hai băng là DsRed (730 bp) và pyrG (900 bp). Trong khi đó,

chủng trợ dƣỡng khơng có băng và chủng tự nhiên có một băng pyrG (Hình 3.19B). Sự xuất hiện cả hai đoạn DNA đồng nghĩa với gen DsRed và pyrG đã đƣợc chuyển vào hệ gen của nấm. Chủng A. oryzae VS1 tự nhiên và VS1 xóa gen pyrG đƣợc sử dụng làm đối chứng. Chủng VS1 chỉ khuếch đại đƣợc gen pyrG và chủng trợ dƣỡng khơng PCR đƣợc đoạn DNA nào (Hình 3.19B). Bên cạnh việc xác nhận bằng PCR, chủng R1 còn đƣợc quan sát sự phát huỳnh quang dƣới kính hiển vi huỳnh quang và

thu đƣợc tín hiệu huỳnh quang đỏ khá tốt (Hình 3.19C). Từ kết quả PCR và quan sát huỳnh quang, có thể kết luận gen DsRed đã đƣợc biểu hiện thành công vào

chủng A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil.

Ngoài việc chuyển DsRed vào chủng VS1 trợ dƣỡng, chúng tôi đồng thời

chuyển vào chủng AUT1-PlD. Gen chỉ thị DsRed trong vector nhị thể pEX1 đƣợc điều khiển bởi promoter gpdA có nguồn gốc từ A. nidulans. Promoter gpdA khá

mạnh dẫn tới một số thể chuyển gen biểu hiện tốt và xuất hiện màu hồng đến đỏ ngay khi quan sát bằng mắt thƣờng. Bào tử chủng AUT1-PlD và chủng AUT1-PlD chuyển gen DsRed đƣợc cấy trên môi trƣờng M+Met, sau 3 ngày nhận thấy màu sắc của chủng chuyển gen hồng rõ rệt. Trong khi đó, chủng khơng chuyển gen khơng có màu (Hình 3.20A). Tuy nhiên, khơng phải tất cả các thể chuyển gen đều có thể quan sát đƣợc màu đỏ bằng mắt thƣờng. Thực tế cho thấy chỉ một số chủng biểu hiện mạnh mới có thể quan sát đƣợc bằng mắt thƣờng. Chủng AUT1-PlD chuyển gen

DsRed đƣợc xác nhận bằng PCR sử dụng cặp mồi DsRed-F/DsRed-R. Kết quả điện

di trên gel xuất hiện đoạn DNA có kích thƣớc 730 bp, bằng kích thƣớc của gen

DsRed (Hình 3.20B). Sự có mặt của gen DsRed trong hệ gen khiến hệ sợi chủng

chuyển gen phát tín hiệu huỳnh quang đỏ khi quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang (Hình 3.20C).

GFP và DsRed là các gen chỉ thị huỳnh quang đƣợc sử dụng nhiều nhất trong

chuyển gen vào nấm [32, 52, 77]. Trong nghiên cứu này, gen chỉ thị huỳnh quang

GFP và DsRed dƣới sự điều khiển của promoter gpdA từ Aspergillus nidulans lần

đầu tiên biểu hiện thành công ở A. oryzae sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (Hình 3.16- 3.20).

Hình 3.20. Biểu hiện gen DsRed ở chủng AUT1-PlD trợ dƣỡng uridine/uracil. A. Chủng AUT1-PlD::DsRed có màu đỏ trên mơi trƣờng M+Met. B. Xác nhận thể

chuyển gen bằng PCR gen DsRed. C. Hệ sợi nấm dƣới kính hiển vi ánh sáng thƣờng (trái) và ánh sáng huỳnh quang (phải).

Sự biểu hiện của gen DsRed dƣới sự kiểm soát của promoter này thậm chí

dẫn đến kiểu hình đỏ trên đĩa môi trƣờng tƣơng tự một số nấm sợi khác nhƣ

Acremoniumchrysogenum và Penicillium paxilli [32, 64]. Điều này cho thấy biểu hiện của gen dƣới sự điều khiển của promoter gpdA từ A. nidulans có hiệu quả trên các lồi nấm khác nhau thuộc chi Aspergillus. Promoter gpdA trong các vector nhị

thể mà chúng tơi tạo đƣợc trong nghiên cứu này có thể đƣợc thay thế một cách dễ dàng bằng các promoter mạnh khác của A. oryzae nhƣ amyB, melO, glaA hoặc tef1 để nâng cao hiệu quả biểu hiện gen trên loài nấm sợi an toàn này. Nghiên cứu chuyển thành công các gen chỉ thị huỳnh quang vào A. oryzae bằng vi khuẩn A.

quốc tế ISI là World Journal of Microbiology and Biotechnology của nhà xuất bản Springer (Đức) năm 2016 [71].

3.5. Ứng dụng hệ thống chuyển gen mới thiết lập để biểu hiện gen phyA mã hóa enzyme phytase của A. fumigatus ở A. oryzae