Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Xây dựng hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens
3.3.2. Tạo một số vectornhị thể dùng cho chuyển gen vào A oryzae trợ dƣỡng
dƣỡng uridine/uracil
Nấm sợi A. oryzae đã đƣợc nghiên cứu chuyển gen nhiều năm nay, tuy nhiên phƣơng pháp duy nhất là chuyển gen thông qua tế bào trần [19, 59, 103, 116]. Phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng marker là gen kháng kháng sinh đã chuyển thành công trên khá nhiều loài nấm sợi. Tuy nhiên phƣơng pháp này chƣa đƣợc áp dụng với A. oryzae bởi đặc tính kháng tự nhiên với nhiều loại kháng sinh. Do đó gen trợ dƣỡng pyrG là một lựa chọn tối ƣu để sử dụng
làm marker chuyển gen vào A. oryzae. Các vector nhị thể có chứa marker pyrG sẽ
đƣợc chuyển vào các chủng A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil.
3.3.2.1.Vector pEX1 biểu hiện gen huỳnh quang xanh GFP
Vector nhị thể pEX1 đƣợc cải biến từ vector pGreen2. Vector pEX1 chứa marker chọn lọc là gen pyrG có nguồn gốc từ nấm sợi A. oryzae. Marker pyrG có kích thƣớc 1,82 kb bao gồm 0,54 kb vùng promoter; 0,90 kb vùng mã hóa và 0,38 kb vùng terminator. Cấu trúc biểu hiện gen pyrG đƣợc khuếch đại từ genome chủng A. oryzae
RIB40, sử dụng cặp mồi P5/P6. Sản phẩm PCR đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn EcoRI và SpeI sau đó đƣợc nối vào vector pGreen2 (cũng đã đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn
EcoRI/SpeI và điện di loại bỏ gen HPH). Sơ đồ tạo vector pEX1 đƣợc mơ tả trên Hình
3.12A.
Vector mới pEX1 đƣợc xác nhận bằng cắt enzyme giới hạn XbaI. Enzyme XbaI có một trình tự nhận biết trong gen pyrG và một vị trí nhận biết trong vector,
do đó enzyme này đƣợc sử dụng để kiểm tra sự có mặt của gen pyrG. Sơ đồ vị trí cắt enzyme giới hạn đƣợc mơ tả trên Hình 3.12B. Theo tính tốn, enzyme hạn chế này cắt plasmid tạo một đoạn 4,09 kb. Kết quả thu đƣợc từ gel agarose chỉ ra rằng vector pEX1 hồn tồn chính xác (Hình 3.12B). Tổng kích thƣớc của pEX1 là 10,95 kb với vùng T-DNA là 4,9 kb mang marker pyrG và gen chỉ thị GFP dƣới sự điều
khiển của promoter gpdA (PgpdA) và terminator trpC (TtrpC) có nguồn gốc từ nấm
Aspergillus nidulans. Promoter gpdA điều hòa biểu hiện của gen GFP và gen này có
thể đƣợc thay thế bằng một gen quan tâm khác sử dụng các vị trí enzyme giới hạn
Hình 3.12. Tạo vector pEX1chứa marker trợ dƣỡng pyrG và gen huỳnh quang xanh
GFP. A. Sơ đồ tạo vector pEX1, bằng cách nối cấu trúc biểu hiện gen pyrG từ A. oryzae thay cho cấu trúc biểu hiện gen kháng kháng sinh hygromycin (HPH) trên
vector pGreen2. B. Sơ đồ cắt giới hạn kiểm tra vector pEX1 bằng enzyme XbaI và ảnh điện di kết quả cắt
3.3.2.2. Vector pEX2 biểu hiện gen huỳnh quang đỏ DsRed
Vector nhị thể pEX2 đƣợc tạo dựa trên vector pEX1. Gen chỉ thị DsRed
đƣợc khuếch đại từ vector pPK2-DsRed sử dụng cặp mồi DsRed-F/DsRed-R (Bảng 2.2). Sau khi cắt bằng enzyme XhoI và BamHI, gen DsRed đƣợc nối vào vector
pEX1 tại các vị trí enzyme tƣơng ứng để thay thế gen GFP. Vector nhị thể thu đƣợc đặt tên là pEX2 (Hình 3.13A). Vector pEX2 đƣợc xác nhận bằng cắt kiểm tra kết hợp hai 2 enzyme giới hạn StuI và HindIII. Sản phẩm cắt tạo thành một đoạn DNA
kích thƣớc 1,05 kb (Hình 3.13B). Các kết quả thu đƣợc đã chứng minh vector pEX2 đã đƣợc tạo thành công. Đặc biệt, phần liền kề với gen DsRed trong pEX2 đã đƣợc bổ sung thêm một số trình tự nhận biết cho các enzyme giới hạn PmlI, AflII, SacI và
SacII (Hình 3.13A) nhằm tạo thuận lợi cho việc thay thế gen chỉ thị DsRed bằng các
gen mong muốn khác.
Hình 3.13. Tạo vector pEX2chứa marker trợ dƣỡng pyrG và gen huỳnh quang đỏ
DsRed. A. Tạo vector pEX2 cải biến từ vector pEX1 bằng cách nối gen DsRed thay
cho gen GFP, tại vị trí enzyme giới hạn XhoI/BamHI. B. Sơ đồ cắt kiểm tra pEX2 bằng enzyme giới hạn StuI/HindIII và ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt.
3.3.2.3. Vector pEX3 biểu hiện gen phyA mã hóa enzyme phytase từ A. fumigatus
Bên cạnh việc biểu hiện gen chỉ thị huỳnh quang để kiểm tra sự hoạt động của hệ thống chuyển gen, chúng tôi đã tạo một vector biểu hiện gen phyA mã hóa
enzyme phytase nguồn gốc từ nấm sợi A. fumigatus. Vector mới đƣợc đặt tên là
pEX3. cDNA của gen phyA có kích thƣớc 1,51 kb đƣợc khuếch đại từ cDNA của
chủng Aspergillus fumigatus VTCC F1414. Sản phẩm PCR sau khi cắt bằng
enzyme giới hạn PmlI/BamHI đƣợc nối vào vector pEX2 thay thế gen DsRed. Sơ đồ tạo vector pEX3 đƣợc mơ tả ở Hình 3.14A.
Hình 3.14. Tạo vector pEX3 biểu hiện enzyme phytase. A. Tạo vector pEX3 cải
biến từ vector pEX2 bằng cách nối gen phyA thay cho gen DsRed, tại vị trí enzyme giới hạn PmlI/BamHI. B. Sơ đồ cắt kiểm tra pEX3 bằng enzyme giới hạn XhoI/
XbaI và ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt.
Vector pEX3 đƣợc xác nhận bằng cắt kiểm tra sử dụng hai enzyme giới hạn
XhoI và XbaI. Enzyme XhoI có một vị trí cắt trong gen phyA và một vị trí cắt bên
ngồi gen. Vị trí nhận biết của các enzyme cắt giới hạn trên vector đƣợc mơ tả tại sơ đồ Hình 3.14B. Sản phẩm cắt dự tính thu đƣợc 4 đoạn DNA có kích thƣớc 6,86 kb; 2,62 kb; 1,95 kb và 0,28 kb. Điện di sản phẩm cắt thu đƣợc các đoạn DNA có kích thƣớc giống với kết quả dự tính khẳng định gen phyA đã đƣợc nối chính xác vào vector.