Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.4. Phân biệt A oryzae và A Flavus bằng các kỹ thuật sinh học phân tử
Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ITS1/ITS4: Cặp mồi ITS1/ITS4 đƣợc sử
dụng để khuếch đại vùng ITS (gồm một phần gen 18S rRNA + ITS1 + gen 5,8S rRNA + ITS2 + một phần gen 28S rRNA) của DNA ribosome. Phản ứng PCR cặp mồi này đƣợc dùng để kiểm tra chất lƣợng DNA của A. oryzae và A. flavus trƣớc khi sử dụng cho phản ứng phân biệt với mồi đặc hiệu. Chu trình nhiệt nhƣ sau: 94ºC (3 phút); 30 chu kì của 94ºC (30 giây), 58ºC (30 giây), 72ºC (40 giây); 72ºC (5 phút). Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra.
Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Aof-ITS-F/ITS4: Mồi Aof-ITS-F đƣợc
thiết kế dựa trên trình tự ITS1 đặc hiệu chỉ với A. oryzae và A. flavus. Mồi
Aof-ITS-F kết hợp với mồi ITS4 đƣợc dùng để nhận biết nhóm bao gồm A. oryzae và A. flavus. Chu trình PCR tƣơng tự nhƣ PCR sử dụng cặp ITS1/ITS4.
Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi AFB-F/AFB-R: Sản phẩm PCR có băng
đặc trƣng và chỉ xuất hiện ở nấm sợi A. flavus mà không xuất hiện ở A. oryzae. Do đó, cặp mồi này đƣợc sử dụng để phân biệt hai lồi này. Chu trình nhiệt nhƣ sau: 94ºC (3 phút); 30 chu kì của 94ºC (30 giây), 58ºC (30 giây), 72ºC (20 giây); 72ºC (5 phút). Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
Phản ứng PCR đa mồi (multiplex PCR): cũng tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR
thƣờng nhƣng đƣợc thực hiện với 5 mồi đặc hiệu (ITS1, ITS4, Aof-ITS-F, AFB-F, AFB-R). Các thành phần trong tổng thể tích 10 àl phn ng bao gm: 5 àl GoTaqđ Mastermix 2X; 0,5 µl mỗi mồi; 100-200 ng DNA tổng số; 2 µl nƣớc cất khử ion.
Chu trình nhiệt nhƣ sau: 94ºC (3 phút), 30 chu kì của 94ºC (30 giây), 60ºC (30 giây), 72ºC (1 phút 30 giây); 72ºC (10 phút). Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra.