Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen với gen huỳnh quang GFP và
3.4.1. Chuyển gen GFP và DsRed vào nấm sợi A oryzae trợ dƣỡng
Để đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen mới tạo đƣợc, chúng tôi sử dụng 2 vector pEX1 và pEX2 (biểu hiện protein huỳnh quang GFP và DsRed) để
đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 bằng phƣơng pháp xung điện.
Quy trình chuyển gen vào A. oryzae với những thông số tối ƣu đƣợc dựa trên
phƣơng pháp ATMT đã áp dụng thành công ở các loại nấm sợi khác nhƣ A. fumigatus, A.niger, Verticillium dahliae, Fusarium oxysporum... [12, 42, 50, 62,
68]. Các tế bào vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng cảm ứng (IM), bổ sung hợp chất phenolic acetosyringone (AS) với nồng độ 200 µM để kích thích q trình chuyển T-DNA. Ngồi ra, mơi trƣờng cảm ứng IM cần bổ sung 0,05% uridine và 0,05% uracil để bào tử A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil có thể sinh trƣởng và q trình chuyển gen xảy ra. Bào tử tƣơi với nồng độ 106 bào tử/ml (đối với chủng VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil) hoặc 107 bào tử/ml (đối với chủng AUT1-PlD) đƣợc sử dụng và thời gian đồng nuôi cấy là 60 giờ (2,5 ngày) ở 22ºC để thu đƣợc nhiều thể chuyển gen trên mơi trƣờng chọn lọc. Tất cả các bƣớc chính để chuyển gen vào A.
oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil bằng phƣơng pháp ATMT đƣợc mô tả trên Hình
3.15.
Hình 3.15. Quy trình tối ƣu cho chuyển gen vào A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil
Các thể chuyển gen GFP và DsRed đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng M+ Met
có bổ sung kháng sinh cefotaxime (300 µg/ml) để diệt vi khuẩn A. tumefaciens.
Chuyển gen vào chủng A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil sử dụng bào tử nồng độ 106
bào tử/ml thu đƣợc 15-20 khuẩn lạc/đĩa. Trong khi đó, chủng AUT1-PlD cần nồng độ 107 bào tử/ml và chỉ thu đƣợc trung bình 2-4 khuẩn lạc/đĩa (Hình 3.16). Chủng A. oryzae AUT1-PlD dùng cho nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp đƣợc cải biến di truyền từ chủng RIB40. Chủng này đã đƣợc xóa gen pyrG, ligD và một số gen khác [116]. Gen ligD liên quan đến khả năng tích hợp một đoạn DNA ngoại lai vào hệ gen của nấm (quá trình NHEJ: Non-homologous end joining) [55, 65]. Bởi vậy, gen ligD bị xóa khỏi hệ gen của chủng AUT1-PlD có thể ảnh hƣởng tới khả năng tích hợp T-DNA trong q trình chuyển gen vào chủng này. Điều đó lý giải tại sao hiệu quả chuyển gen vào chủng AUT1-PlD lại thấp hơn nhiều so với chủng VS1.
Hình 3.16. Chuyển gen chỉ thị huỳnh quang GFP và DsRed vào các chủng A.
oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil. A. Chuyển gen GFP vào chủng VS1. B. Chuyển
Gen chỉ thị GFP và DsRed đƣợc điều hịa bởi cùng promoter gpdA có nguồn gốc từ A. nidulans. Do đó hiệu quả chuyển gen cũng nhƣ mức độ biểu hiện của hai gen tƣơng đối giống nhau. Trên đĩa chọn lọc của chủng VS1, các thể chuyển gen khi chuyển gen GFP và DsRed đều thu đƣợc trung bình 15-20 khuẩn lạc/đĩa. Tƣơng tự, chủng AUT1-PlD thu đƣợc 2-4 khuẩn lạc/đĩa (Hình 3.16). Hiện nay, phƣơng pháp ATMT sử dụng marker kháng kháng sinh đã đƣợc chứng minh chuyển gen hiệu quả vào một số loài nấm sợi khác nhau, có trƣờng hợp đạt đến 1.000 thể chuyển gen trên mỗi 107 bào tử [12]. Ngƣợc lại, phƣơng pháp ATMT sử dụng marker trợ dƣỡng pyrG chỉ mới đƣợc áp dụng chuyển gen vào Trichoderma reesei
(hiệu quả 10-20 thể chuyển gen/105 bào tử) và Aspergillus aculeatus (100-200 thể chuyển gen/107 bào tử) [42, 115]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh hai vector nhị thể pEX1 và pEX2 chứa marker trợ dƣỡng pyrG có thể đƣợc sử dụng để chuyển gen vào A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil với hiệu quả chuyển gen
tƣơng đối ổn định, khoảng 150-200 thể chuyển gen/106 bào tử đối với chủng VS1.