Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.2. Tách chiết DNA, RNA và tổng hợp cDNA
Tách chiết DNA tổng số: 1 ml bào tử nấm đƣợc bổ sung vào bình tam giác
250 ml chứa 100 ml mơi trƣờng CD lỏng. Bình đƣợc ni lắc trong máy lắc tốc độ 200 vòng/phút, ở 30ºC trong 3 ngày. Hệ sợi nấm đƣợc thu bằng cách lọc qua màng Miracloth và đƣợc thấm khô bằng giấy lọc trƣớc khi chia vào ống eppendorf 2 ml. Khoảng 200 mg sợi nấm đƣợc nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn bằng cối chày sứ hoặc đƣợc giã trực tiếp trong ống eppendorf sử dụng đũa thủy tinh. Bổ sung 600 µl đệm chiết GX (2,5% SDS; 200 mM Tris-HCl pH 8,0; 250 mM NaCl; 25 mM EDTA; 0,2% β-mercaptoethanol) và 0,1 mg proteinase K. Ống đƣợc vortex đều sau đó ủ ở nhiệt độ 60- 65ºC trong 15- 30 phút. Thêm vào ống 300 µl natri acetate 3M (pH 5,2) trộn đều và ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 20 phút ở 4ºC. Hút khoảng 700 µl dịch trong ở phía trên chứa DNA và chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml. Ống đƣợc bổ sung thêm 700 µl isopropanol lạnh, trộn đều sau đó ly tâm ở 12000 vịng/phút trong 20 phút ở 4ºC. Tủa chứa DNA đƣợc rửa bằng 500 µl ethanol 70% và đƣợc làm khơ bằng máy cô quay chân không SpeedVac trƣớc khi hịa vào 50 µl đệm TE 1x (Tris-EDTA, pH 8). Bổ sung 2 µl RNase (10 mg/ml) và ủ ở 60ºC trong 30 phút để loại bỏ RNA. Sản phẩm DNA tổng số đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và đƣợc bảo quản ở -20ºC.
Tách chiết RNA tổng số: Sợi nấm 2 ngày tuổi đƣợc thu bằng cách lọc dịch
nuôi qua màng Miracloth và đƣợc nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng. Bột sợi nấm nhanh chóng đƣợc chia vào ống eppendorf 2 ml (20-50 mg/ống) và đặt trên nƣớc đá. RNA tổng số đƣợc chiết bằng kit tinh sạch RNA của hãng ANABIO R&D JSC theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. RNA sau khi tinh sạch đƣợc xử lý 20 phút ở 37ºC bằng enzyme DNase I để loại bỏ hồn tồn DNA. DNase I sau đó đƣợc bất hoạt ở 75ºC trong 15 phút và mẫu đƣợc chuyển ngay lên nƣớc đá. Sản phẩm RNA thu đƣợc đƣợc kiểm tra bằng PCR để đánh giá mức độ tinh sạch, sử dụng cặp mồi ITS1/ITS4 để khuếch đại đoạn ITS của DNA ribosome. RNA đƣợc coi là sạch và không nhiễm DNA hệ gen chỉ khi phản ứng PCR kiểm tra không xuất hiện băng
ITS. RNA sau khi tinh sạch đƣợc sử dụng ngay cho tổng hợp cDNA hoặc đƣợc bảo quản ở -30ºC.
Tổng hợp cDNA: RNA tổng số sau khi tinh sạch đƣợc sử dụng ngay để tổng
hợp cDNA. Một lƣợng 800-1000ng RNA đƣợc sử dụng cho một phản ứng tổng hợp cDNA với mồi oligo dT và enzyme phiên mã ngƣợc reverse transcriptase. Tồn bộ quy trình đƣợc thực hiện với ProtoScript® First Strand cDNA Synthesis Kit của hãng New England Biolabs theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm cDNA đƣợc sử dụng ngay cho các thí nghiệm tiếp theo hoặc đƣợc bảo quản ở -30ºC.
2.2.3. Quan sát hình thái và kiểm tra một số đặc điểm sinh lý sinh hóa
Quan sát hình thái các chủng A. oryzae: Các chủng nấm đƣợc cấy điểm hoặc nhỏ 10 µl bào tử trên mơi trƣờng đĩa thạch PDA hoặc CD đối với các chủng tự nhiên và M+ Met hoặc CD bổ sung thêm uridine/uracil với chủng AUT1-PlD và những chủng trợ dƣỡng uridine/uracil. Đĩa nuôi cấy đƣợc ở 30ºC-37ºC trong 2-3 ngày. Hình thái bào tử và cuống mang bào tử đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi quang học Olympus hoặc kính hiển vi huỳnh quang Axioplan (Carl Zeiss, Đức).
Kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của các chủng A. oryzae: 10 µl
dịch bào tử các chủng A. oryzae đƣợc nhỏ trên môi trƣờng CD pH7 có bổ sung
kháng sinh với các nồng độ 100mg/l, 200 mg/l và 300 mg/l. Đĩa nuôi cấy đƣợc đặt ở 30ºC trong 3 ngày để quan sát sự sinh trƣởng của nấm.
Kiểm tra khả năng sinh enzyme phytase[29]: 10 µl bào tử nấm đƣợc nhỏ lên
đĩa môi trƣờng PSM. Đĩa nuôi cấy đƣợc đặt ở 30ºC trong 3 ngày. Enzyme phytase sẽ phân giải phytate tạo thành vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc. Vòng phân giải càng lớn thì mức độ sinh enzyme và hoạt tính enzyme càng mạnh.
Kiểm tra khả năng sinh enzyme amylase [100]: 10 µl bào tử nấm đƣợc nhỏ
lên đĩa môi trƣờng CD+ 1% tinh bột tan (pH 6,5). Sau 3 ngày sinh trƣởng ở 30ºC, vòng phân giải tinh bột xung quanh khuẩn lạc nấm đƣợc nhận biết bằng cách nhỏ dung dịch thuốc thử lugol.
Xác định khả năng sinh độc tố aflatoxin trên môi trường CAM [82]: Các
chủng A. oryzae RIB40, A. oryzae VS1, A. flavus NRRL 3357 đƣợc nuôi cấy trên
môi trƣờng thạch dừa (môi trƣờng CAM) ở 28ºC, trong tối 5 ngày. Quan sát đĩa ni cấy dƣới ánh sáng cực tím UVA bƣớc sóng 365 nm của máy soi UV để kiểm tra sự phát quang màu xanh lá cây của aflatoxin B1. Môi trƣờng CAM đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: 100 g dừa tƣơi thái nhỏ đun sôi 15 phút trong 300 ml nƣớc, lọc thu dịch, bổ sung 2% agar, pH 7.
2.2.4. Phân biệt A. oryzae và A. Flavus bằng các kỹ thuật sinh học phân tử Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ITS1/ITS4: Cặp mồi ITS1/ITS4 đƣợc sử Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ITS1/ITS4: Cặp mồi ITS1/ITS4 đƣợc sử
dụng để khuếch đại vùng ITS (gồm một phần gen 18S rRNA + ITS1 + gen 5,8S rRNA + ITS2 + một phần gen 28S rRNA) của DNA ribosome. Phản ứng PCR cặp mồi này đƣợc dùng để kiểm tra chất lƣợng DNA của A. oryzae và A. flavus trƣớc khi sử dụng cho phản ứng phân biệt với mồi đặc hiệu. Chu trình nhiệt nhƣ sau: 94ºC (3 phút); 30 chu kì của 94ºC (30 giây), 58ºC (30 giây), 72ºC (40 giây); 72ºC (5 phút). Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra.
Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Aof-ITS-F/ITS4: Mồi Aof-ITS-F đƣợc
thiết kế dựa trên trình tự ITS1 đặc hiệu chỉ với A. oryzae và A. flavus. Mồi
Aof-ITS-F kết hợp với mồi ITS4 đƣợc dùng để nhận biết nhóm bao gồm A. oryzae và A. flavus. Chu trình PCR tƣơng tự nhƣ PCR sử dụng cặp ITS1/ITS4.
Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi AFB-F/AFB-R: Sản phẩm PCR có băng
đặc trƣng và chỉ xuất hiện ở nấm sợi A. flavus mà không xuất hiện ở A. oryzae. Do đó, cặp mồi này đƣợc sử dụng để phân biệt hai lồi này. Chu trình nhiệt nhƣ sau: 94ºC (3 phút); 30 chu kì của 94ºC (30 giây), 58ºC (30 giây), 72ºC (20 giây); 72ºC (5 phút). Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
Phản ứng PCR đa mồi (multiplex PCR): cũng tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR
thƣờng nhƣng đƣợc thực hiện với 5 mồi đặc hiệu (ITS1, ITS4, Aof-ITS-F, AFB-F, AFB-R). Các thành phần trong tổng thể tích 10 àl phn ng bao gm: 5 àl GoTaqđ Mastermix 2X; 0,5 µl mỗi mồi; 100-200 ng DNA tổng số; 2 µl nƣớc cất khử ion.
Chu trình nhiệt nhƣ sau: 94ºC (3 phút), 30 chu kì của 94ºC (30 giây), 60ºC (30 giây), 72ºC (1 phút 30 giây); 72ºC (10 phút). Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra.
2.2.5. Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen
PCR các đoạn DNA: Trình tự các đoạn DNA đƣợc lấy từ cơ sở dữ liệu của
ngân hàng GenBank, các cặp mồi khuếch đại gen hoặc DNA đƣợc thiết kế trên phần mềm Primer3 và đƣợc tổng hợp hóa học bởi cơng ty IDT. Các đoạn DNA đƣợc PCR từ DNA tổng số hoặc cDNA sử dụng enzyme Phusion® High-Fidelity DNA polymerase của hãng Thermo Scientific. Thành phần trong 25 µl hỗn hợp phản ứng nhƣ sau: buffer 5x HF 5 µl, enzyme Phusion DNA polymerase 1 µl, dNTP 1 µl, mồi xi 1 µl, mồi ngƣợc 1 µl, DNA khn 1 µl, nƣớc cất khử ion 15 µl. Chu trình nhiệt nhƣ sau: 94ºC (3 phút); 35 chu kỳ của 94ºC (30 giây), 50-60ºC (30 giây), 72ºC (30 giây đến 1 phút); 72ºC (7 phút). Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% sau đó đƣợc tinh sạch bằng kit tinh sạch DNA của hãng Promega hoặc Anabio R&D JSC theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Xử lý vector và đoạn DNA với enzyme giới hạn: Các vector và đoạn DNA
đƣợc cắt với enzyme giới hạn dạng FastDigest của hãng Thermo Scientific. Quy trình xử lý enzyme theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm xử lý enzyme giới hạn đƣợc điện di trên gel agarose 0,8%. Đoạn DNA trên gel đƣợc cắt và chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml. Quy trình tinh sạch đƣợc thực hiện với kit tinh sạch DNA thƣơng mại theo sự hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm sau tinh sạch đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
Nối đoạn DNA vào plasmid (ligation): Plasmid và đoạn DNA sau khi xử lý
enzyme giới hạn và tinh sạch đƣợc trộn với tỉ lệ 1:1 theo thể tích, sử dụng enzyme nối T4 DNA ligase của hãng Thermo Scientific. Các thành phần trong 20 µl hỗn hợp phản ứng nhƣ sau: T4 ligase buffer 10x 2 µl, enzyme T4 DNA ligase 1 µl, plasmid 4 µl, đoạn DNA 4 µl, nƣớc cất khử ion 9 µl. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 4ºC-10ºC qua đêm, sau đó đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α bằng phƣơng
pháp sốc nhiệt. Quá trình biến nạp nhƣ sau: ống chứa tế bào vi khuẩn E. coli DH5α đƣợc giữ trên nƣớc đá 5-10 phút cho tới khi rã đông. Hút hỗn hợp lai vào ống tế bào khả biến, trộn nhẹ bằng pipet và đặt trên đá 20 phút. Sau đó sốc nhiệt 40 giây ở 42ºC và đặt trên nƣớc đá 2 phút. Bổ sung 800 µl LB lỏng và ống đƣợc lắc 1 giờ ở 37ºC. Tế bào đƣợc thu bằng ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 20 giây và đƣợc trải trên đĩa môi trƣờng chọn lọc LB chứa kháng sinh kanamycin (100 mg/l). Đĩa đƣợc ủ ở 37ºC trong 24 giờ. Các khuẩn lạc nhận đƣợc từ đĩa chọn lọc đƣợc kiểm tra bằng colony-PCR (PCR từ khuẩn lạc) với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA. Phản ứng colony-PCR sử dụng GoTaq® Green Master Mix của hãng Promega. Những khuẩn lạc cho kết quả PCR đúng với kích thƣớc của đoạn chèn sẽ đƣợc sử dụng để tách chiết plasmid và cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn.
Tách plasmid: Khuẩn lạc chọn đƣợc cấy vào bình tam giác 100 ml chứa 10-
20 ml môi trƣờng LB lỏng (1% peptone; 0,5% cao nấm men; 0,5% NaCl) bổ sung thêm kháng sinh kanamycin (100 mg/l). Bình ni cấy đƣợc lắc qua đêm ở 30- 37ºC. Ly tâm 4 ml dịch ni ở 12000 vịng/phút trong 20 giây (ly tâm 2 lần, mỗi lần 2 ml). Bổ sung 250 µl buffer B1 (50 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 7,6) và 3 µl RNase (10 mg/ml). Cặn tế bào đƣợc hòa tan vào đệm bằng vortex. Bổ sung thêm 250 µl buffer B2 (200 mM NaOH, 1% SDS) sau đó đảo ống nhẹ nhàng 5 lần. Tiếp đó bổ sung thêm 350 µl buffer N3 (kali acetate 3M; pH 5,5) và đảo ống nhẹ 5 lần. Ly tâm ống ở 12000 vòng/phút ở 4ºC trong 20 phút. Hút khoảng 700 µl dịch trong có chứa plasmid chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml và bổ sung thêm 700 µl isopropanol lạnh. Ống đƣợc trộn đều bằng vortex đều và đƣợc ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 20 phút ở 4ºC. Đổ bỏ dịch trong và rửa cặn bằng 500 µl ethanol 70%. Ly tâm 5 phút và đổ bỏ dịch. Cặn chứa DNA đƣợc làm khô bằng máy cô quay chân không SpeedVac và hịa vào 50 µl đệm TE 1x. Plasmid đƣợc bảo quản ở ngăn đá tủ lạnh hoặc ở -30ºC.
Tạo vector xóa gen pyrG ở A. oryzae: Cấu trúc xóa gen pyrG ở A. oryzae đƣợc thiết kế nằm trong vùng T-DNA trên một vector nhị thể (binary vector), cấu
trúc này sẽ đƣợc đƣa vào A. oryzae bằng phƣơng pháp chuyển gen trung gian qua vi khuẩn A. tumefaciens. Vector xóa gen đƣợc tạo ra dựa trên khung của vector nhị thể pGreen2 [102]. Đoạn DNA dài 1,41 kb tƣơng ứng với vùng 5’ của gen pyrG (5’ pyrG: đoạn DNA phía trƣớc phần mã hóa) và đoạn DNA dài 1,33 kb tƣơng ứng
vùng 3’ của gen pyrG (3’ pyrG: đoạn DNA phía sau phần mã hóa) đƣợc khuếch đại bằng enzyme Phusion® High-Fidelity DNA polymerase sau đó đƣợc nối vào vector pGreen2. Cụ thể nhƣ sau: vector pGreen2 đƣợc xử lý bằng enzyme giới hạn
EcoRI/XhoI, điện di để loại bỏ đoạn 3,5 kb và đoạn khung vector (8,3 kb) đƣợc tinh
sạch để nối với đoạn DNA 5’pyrG cũng đã đƣợc cắt với cùng enzyme giới hạn
EcoRI/XhoI. Sau đó đoạn 3’ pyrG đƣợc nối vào vector tại trình tự cắt của enzyme XhoI/HindIII. Vector mới tạo chứa cả đoạn 5’ pyrG và 3’ pyrG liền kề nhau đƣợc xác nhận bằng PCR và bằng cắt enzyme giới hạn trƣớc khi biến nạp vào vi khuẩn A.
tumefaciens AGL1 sử dụng phƣơng pháp xung điện.
Tạo vector biểu hiện gen huỳnh quang xanh GFP: Vector biểu hiện gen
GFP với marker chọn lọc là gen trợ dƣỡng uridine/uracil (pyrG) đƣợc cải biến từ
vector pGreen2. Cấu trúc biểu hiện gen pyrG của A. oryzae dài 1,8 kb gồm trình tự promoter (vùng 5’ của gen), phần gen mã hóa và đoạn teminator (vùng 3’ của gen) đƣợc khuếch đại từ DNA tổng số của chủng A. oryzae RIB40. Gen pyrG đƣợc nối
vào vector pGreen2 tại vị trí của enzyme giới hạn EcoRI và SpeI để thay thế cấu
trúc biểu hiện gen kháng kháng sinh hygromycin (HPH). Vector nhị thể tạo thành đƣợc đặt tên là pEX1.
Tạo vector biểu hiện gen huỳnh quang đỏ DsRed: Gen mã hóa protein
huỳnh quang đỏ DsRed khuếch đại từ vector ppK2-DsRed do phịng thí nghiệm
Genomic cung cấp với cặp mồi đặc hiệu DsRed-F/DsRed-R. Sản phẩm thu đƣợc đƣợc tinh sạch và đƣợc nối vào vector pEX1 tại vị trí enzyme giới hạn XhoI và BamHI để thay thế cho gen GFP. Hai đầu của gen DsRed đƣợc bổ sung thêm trình
tự nhận biết của một số enzyme giới hạn (PmlI, AflII, EcoRV, SacI, SacII) để thuận lợi cho việc thay gen DsRed bằng gen mong muốn. Vector nhị thể thu đƣợc đặt tên là pEX2.
2.2.6. Chuyển gen vào nấm sợi A. oryzae
2.2.6.1. Biến nạp vector nhị thể vào vi khuẩn A. tumefaciens AGL1
Vector đƣợc biến nạp vào chủng vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 bằng phƣơng pháp xung điện. Khuẩn lạc AGL1 đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng LB lỏng qua đêm, ở 28ºC. Dịch vi khuẩn đƣợc ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút ở 4ºC. Cặn chứa tế bào vi khuẩn đƣợc rửa 3 lần bằng HEPES 100 mM và 1 lần bằng glycerol 10% và hòa trong 1 ml glycerol 10%. Hỗn hợp chứa 40 µl dịch tế bào và 200 ng plasmid đƣợc chuyển vào cuvet 2 mm và đặt trên nƣớc đá. Biến nạp bằng xung điện sử dụng máy chuyển gen xung điện Bio-Rad với các thơng số của chƣơng trình là 2,5 kV; 400 Ω; 25 µF. Sau khi bắn xung điện, hỗn hợp đƣợc chuyển sang ống eppendorf 2 ml và bổ sung thêm 500 µl mơi trƣờng LB lỏng và lắc 1 giờ ở 28ºC. Thu tế bào vi khuẩn bằng ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút trong 20 giây, đổ bỏ dịch, hòa tế bào vào phần dịch còn lại và cấy trải trên môi trƣờng LB chứa kháng sinh kanamycin (100 mg/l). Đĩa nuôi cấy đƣợc ủ ở 28ºC trong 72 giờ để thu nhận các khuẩn lạc riêng rẽ. Các khuẩn lạc sau đó đƣợc kiểm tra bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen có mặt trong vector.
2.2.6.2. Chuyển cấu trúc xóa gen pyrG vào nấm sợi A. oryzae
Vector xóa gen pyrG sau khi chuyển vào vi khuẩn A. tumefaciens, sẽ đƣợc
chuyển vào chủng VS1 và RIB40, sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đƣợc mô tả bởi Mullins và cộng sự năm 2001 [68]. Khuẩn lạc tƣơi của vi khuẩn mang vector xóa gen đƣợc ni trên môi trƣờng LB lỏng trong 15-24 giờ ở 28ºC. Sau đó sử dụng 1 ml dịch ni bổ sung vào 9 ml mơi trƣờng IM lỏng có chứa 200 µM acetosyringone (AS), ni lắc 200 vịng/phút ở 28ºC khoảng 5-6 giờ cho đến khi OD600 đạt 0,6-0,8. Hỗn hợp chứa 100 µl bào tử (nồng độ 107 bào tử/ml) và 100 µl dịch vi khuẩn AGL1 đã cảm ứng đƣợc trải đều lên màng cellulose (mã số FT-3-303-085, Sartorius, Đức) đặt sẵn trên đĩa môi trƣờng cảm ứng IM có bổ sung 200 µM AS. Sau 60 giờ đồng ni cấy ở 22ºC, màng cellulose đƣợc chuyển sang đĩa mơi trƣờng chọn lọc có bổ sung 0,5% uridine; 0,2% uracil; 2
g/l 5-FOA và 300 mg/l kháng sinh cefotaxime. Môi trƣờng chọn lọc cho xóa gen
pyrG ở chủng VS1 là CD, và ở chủng RIB40 là PDA (0,4% dịch chiết khoai tây;
2% glucose; 1,6% agar). Đĩa môi trƣờng chọn lọc đƣợc đặt trong tối ở nhiệt độ 30ºC, sau 5-7 ngày sẽ thu đƣợc các thể xóa gen kháng 5-FOA.
Xác nhận các chủng xóa gen pyrG: Các khuẩn lạc nấm riêng rẽ thu đƣợc