Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Lựa chọn marker chuyển gen vào A oryzae
Chất kháng sinh kháng nấm đƣợc sử dụng rất phổ biến để chọn lọc các thể chuyển gen trong quá trình chuyển gen vào nấm sợi. Để lựa chọn marker sử dụng cho nấm sợi A. oryzae, 8 chủng A. oryzae đƣợc kiểm tra khả năng mẫn cảm với ba loại kháng sinh thông dụng dùng trong chuyển gen ở nấm là hygromycin, nourseothricin và phleomycin [12, 39, 67, 79, 105]. Bào tử của các chủng A. oryzae đƣợc nhỏ trên đĩa môi trƣờng có bổ sung kháng sinh ở các nồng độ khác nhau. Sau 3 ngày ủ ở nhiệt độ 30ºC, 8 chủng A. oryzae đƣợc kiểm tra đều kháng lại cả 3 loại kháng sinh ở nồng độ 100, 150 và 200 mg/l (Hình 3.5). Tất cả các chủng A. oryzae đều kháng với kháng sinh hygromycin (Hình 3.5A), trong khi đó nourseothricin
(clonNAT) và phleomycin chỉ ức chế từng phần sự sinh trƣởng của một số chủng khi sử dụng ở nồng độ cao (Hình 3.5B, C).
Hình 3.5. Kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của một số chủng A. oryzae. A. Sinh trƣởng trên môi trƣờng CD bổ sung kháng sinh hygromycin. B. Sinh trƣởng
trên môi trƣờng CD bổ sung kháng sinh clonNAT (nourseothricin). C. Sinh trƣởng trên môi trƣờng CD bổ sung kháng sinh phleomycin.
Do khả năng kháng tự nhiên đối với các kháng sinh nêu trên, nên các nghiên cứu chuyển gen vào A. oryzae cho đến nay phần lớn đều sử dụng marker là gen trợ dƣỡng nhƣ pyrG, adeA, met, trp, argB, niaD [20, 30, 101, 116]. Sử dụng marker trợ dƣỡng có ƣu điểm an tồn và giảm chi phí trong q trình chuyển gen do không cần sử dụng các chất kháng sinh. Trong số các marker trợ dƣỡng đƣợc sử dụng trên nấm
sợi A. oryzae, marker pyrG đƣợc sử dụng nhiều nhất trong chuyển gen. Gen pyrG
liên quan đến quá trình sinh tổng hợp uridine/uracil cần thiết cho sự sống của nấm. Trong hệ gen của A. oryzae, gen pyrG chỉ có một bản sao duy nhất, do đó dễ dàng thực hiện việc loại bỏ gen để tạo thể đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil.