2.1. Vật liệu nghiên cứu
Dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45, do Phịng thí nghiệm Inserm U1053 - Viện Sức khỏe và Nghiên cứu Y học Quốc gia - Cộng hòa Pháp cung cấp, được lưu trữ tại phịng Thí nghiệm Y - Sinh - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại Khoa học - Đại học Thái Nguyên.
Cây Lá khôi (Ardisia gigantifolia) thuộc chi Ardisia họ Đơn nem
(Myrsinaceae) thu thập tại huyện Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên, được bảo quản tại phịng Thí nghiệm Y - Sinh - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại Khoa học - Đại học Thái Nguyên.
2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Môi trường nuôi cấy tế bào RPMI 1640 và DMEM-F12 (Invitrogen), huyết thanh bò (Invitrogen), Trypsin, Kháng sinh Ampicilin/Streptomycin (Invitrogen), DMSO, MTT và propidium iodide (PI) (Sigma) và các Primer do Quiagen cung cấp.
Trang thiết bị nghiên cứu: Kính hiển vi đảo ngược Nikon Eclipe 2 (Nhật Bản); Kính hiển huỳnh quang Olympus (Nhật Bản); Máy đo quang phổ SPECTROstar Nano – BMG Labtech (Đức); Tủ nuôi cấy tế bào ổn nhiệt CO2 (Thermo Fisher Scienetific) và các thiết bị phụ trợ khác.
2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Phịng Thí nghiệm Y - Sinh - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại Khoa học - Đại học Thái Nguyên.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 05/2018 đến tháng 07/2019.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp thu thập và xác định tên khoa học của cây Lá khôi
Sử dụng phương pháp thu thập mẫu cây Lá khơi theo Nguyễn Nghĩa Thìn (2007) [3].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Xác định tên khoa học theo phương pháp chuyên gia, kết hợp với cuốn “Thực vật chí Việt Nam” tập 4, họ Đơn nem (Myrsinaceae) của Trần Thị Kim Liên [9].
2.4.2. Phương pháp thu dịch chiết cây Lá khôi
300 gam mẫu lá của Lá khôi được thu nhận, rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 42°C trong 48h. Tiếp theo, mẫu lá được nghiền nhỏ bằng chày cối sứ thành bột mịn. 15 gam bột thu được sẽ được cho vào ống Falcon thể tích 50ml. Để chiết rút dịch chiết tổng số, 30ml Ethanol tuyệt đối được bổ sung vào ống Falcon chứa 15 gam bột lá và được lắc 200 rpm/ phút trong 48h. Dịch chiết thu được được lọc bằng giấy lọc Whatman, sau đó được làm khơ trong tủ sấy ở nhiệt độ 50°C trong 48h. Cặn thu được sau bay hơi sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.4.3. Phương pháp ni cấy tế bào 2D
Dịng tế bào ung thư dạ dày MKN45 được nuôi cấy trong điều kiện ni cấy bám dính (2D) trong mơi trường DMEM/F12 Glutamax có bổ sung 10% huyết thanh bò (FBS) và 1% hỗn hợp kháng sinh Ampicillin/Streptomycin (P/S), trong điều kiện 37oC, 5% CO2. 100.000 tế bào ung thư dạ dày dịng MKN45 được ni cấy trong hộp ni cấy diện tích 75cm2, trong mơi trường nuôi cấy RPMI 1640 (Invitrogen) bổ sung 10% huyết thanh bị và kháng sinh 1% Penicillin/Streptomycin.
Mơi trường ni cấy được thay ngày một lần bằng một môi trường nuôi cấy mới. Sau 5 ngày nuôi cấy, các tế bào được xử lý với Trypsine 0,05% trong 3 phút. Tế bào được thu lại bằng ly tâm 1.300 rpm/phút trong 5 phút và được cấy chuyển sang một bình ni cấy mới. Tế bào sống, chết được đếm dưới kinh hiển vi đảo ngược Nikon Eclipe 2, sử dụng Trypan blue làm thuốc nhuộm cho tế bào chết.
2.4.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào 3D
Nuôi cấy các tế bào ung thư dạ dày MKN45 với mật độ 2.000 tế bào/giếng ni cấy có diện tích 3,8 cm2, bề mặt khơng bám dính (3D) để hình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn thành nên tumorsphere (khối tế bào ung thư hình cầu). Sử dụng môi trường DMEMF12/Glutamax có bổ sung 1% Ampicillin/Streptomycin, yếu tố tăng trưởng biểu mô EGF 20 ng/ml, yếu tố tăng trưởng thượng bì FGF 20ng/ml, 0,3% Glucose, 5µg/ml Insulin ở 370C, 5% CO2.
2.4.5. Phương pháp phân tích chu kỳ tế bào bằng Flow cytometry
2x105 tế bào của dịng MKN45 được ni cấy trên đĩa loại 12 giếng. Sau 24 giờ, tế bào được xử lý bằng môi trường nuôi cấy chứa dịch chiết Lá khôi ở nồng độ 75 µg/ml. Các giếng đối chứng không bổ sung dịch chiết Lá khôi. Thời gian xử lý là 48 giờ trong điều kiện 370C, 5% CO2. Tiếp theo, các tế bào được tách khỏi bề mặt đĩa bằng cách xử lý với trysin/EDTA và được thu lại bằng ly tâm 1.500 rpm/phút trong 3 phút và được cố định trong ethanol 75% ở -20°C qua đêm. Tiếp theo, tế bào được nhuộm với dung dịch Fluorochrome (0,1% Sodium citrate (wt/v); 0,1% Triton X-100 (v/v), 50 mg l-1 PI trong nước khử ion vô trùng) trong thời gian 2 giờ ở 40C trước khi phân tích bằng hệ thống Flow cytometry BD-Accuri C6 plus (BD-Bioscinces). Kết quả dữ liệu được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng cho hệ thống BD-Accuri C6 plus.
2.4.6. Phương pháp phân tích miễn dịch huỳnh quang
Các tumorsphere sau 5 ngày nuôi cấy được thu nhận bằng ly tâm 1.300 rpm trong 3 phút và rửa 2 lần với đệm PBS 1X. Nhuộm tế bào lần lượt với kháng thể 1 là kháng thể đơn dòng chuột kháng protein P21 của người được cung cấp bởi Santa Cruz, tỷ lệ 1:500 ở 37ºC trong 45 phút và kháng thể 2 kháng IgG của chuột gắn chất phát quang Alexa Fluor 488 do Thermo Scientific cung cấp, nồng độ 1:2.000 ở 37ºC trong 20 phút. Rửa tế bào 2 lần với PBS 1X bằng phương pháp li tâm, ở lần rửa thứ 2 tế bào được rửa trong đệm PBS chứa chất nhuộm nhân tế bào DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindole do Sigma cung cấp) nồng độ 10µg/ml. Các tế bào sau khi được ủ với kháng thể sẽ được đặt trên lamen và được quan sát, chụp ảnh dưới kính hiển vi huỳnh quang NIKON ở độ phóng đại 200 lần với phần mềm chuyên dụng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
2.4.7. Phương pháp tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA
RNA tổng số của tế bào MKN45 được tách chiết bằng Trizol theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Invitrogen). Tế bào nuôi cấy trên đĩa 6 giếng được bổ sung 1.000 µl Trizol, dùng pipette 1ml mix nhiều lần để tách tế bào ra khỏi bề mặt đĩa. Ủ tế bào ở nhiệt độ phịng trong 5 phút, sau đó ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút ở 4ºC. Chuyển dịch nổi sang ống eppendorf mới. Bổ sung 2ml Choloroform, vontex mẫu trong 15 giây và ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút. Ly tâm 10.000 rpm/phút trong 15 phút ở 4ºC, lặp lại 2 lần. Làm khô RNA trong 5 – 10 phút và bổ sung 100 µl nước khử ion. Đo quang phổ tại các bước sóng 260/280 nm bằng máy đo quang phổ NanoDrop. Sử dụng 1µg RNA để tạo cDNA bằng Quantitect Reverse Transcriptase (RT) kit (do Quiagen cung cấp) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.4.8. Phương pháp phân tích biểu hiện gen bằng Realtime PCR
Phân tích Realtime PCR sử dụng 20ng cDNA cho mỗi phản ứng PCR với tổng thể tích là 20 µl với chất phát huỳnh quang SYBR Green qPCR do Invitrogen cung cấp. Danh sách các gen nghiên cứu với mã số cặp mồi tương ứng do Quiagen cung cấp và được trình bày trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Mã số cặp mồi của các gen
Tên gen Mã số cặp mồi Nguồn cung cấp
CD44 QT00073549 Qiagen ALDH QT00013286 Qiagen SOX2 QT00237601 Qiagen CCNE1 QT00041986 Qiagen CCND1 QT00495285 Qiagen P21 QT00006615 Qiagen P27 QT00244993 Qiagen PCNA QT00024633 Qiagen
Ghi chú: Toàn bộ các mồi được Qiagen cung cấp ở dạng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Sự thay đổi về mức độ biểu hiện gen được tính theo phương pháp Delta delta ct (ΔΔCt). Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình của 3 lần lặp lại của thí nghiệm với độ lệch chuẩn SD, cỡ mẫu cho mỗi lần thí nghiệm n=3.
2.4.9. Phương pháp phân tích thống kê
Phân tích giá trị khác biệt về mặt thống kê giữa các nhóm đối chứng và nhóm thí nghiệm theo Mann - Whitney, sử dụng phần mềm GraphPad Prism 5.0.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn