Ni cấy tumorpshere hình thành từ các tế bào gốc

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu tác động của dịch chiết lá khôi (ardisia gigantifolia stapf ) lên sự biểu hiện của các gen kiểm soát chu kỳ tế bào của tế bào gốc ung thư dạ dày​ (Trang 39)

dày MKN45 theo thời gian nuôi cấy từ 0 đến 7 ngày. Thang đo 50 µm. Ảnh chụp ở độ phóng đại 200 lần.

Các tumosphere sau 7 ngày ni cấy có đường kính từ 100 - 300µm. Đây là tiền đề quan trọng để chúng tơi tiến hành thí nghiệm tiếp theo là xử lý các tumorsphere với dịch chiết Lá khơi trước khi tiến hành phân tích ảnh hưởng của dịch chiết lên chu kỳ tế bào và sự biểu hiện của các gen quan tâm.

3.4. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên số lượng và kích thước các tumorsphere tumorsphere

Để khẳng định được ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên sự phát triển của các tumorsphere. Xử lý các tumorsphere sau 5 ngày ni cấy với dịch

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn chiết Lá khơi ở nồng độ 75µg/ml, thời gian xử lý 48h. Đây là nồng độ tương ứng với giá trị IC50 của dịch chiết Lá khôi đã được chỉ ra trong một nghiên cứu trước đó khi đánh giá độc tính của dịch chiết Lá khơi bằng ethanol lên tế bào MKN45 trong điều kiện nuôi cấy 2D [7]. Kết quả chụp ảnh và đo, đếm số lượng tumorsphere dưới kính hiển soi ngược thể hiện trong hình 3.4.

Hình 3.4. Dịch chiết Lá khơi tác động lên khả năng hình thành tumorsphere

và kích thước của tumorsphere. Thang đo 50 µm. Tumorsphere được đếm và đo kích thước ở ngày thứ 5 của q trình ni cấy

Kết quả xử lí các tumorsphere với dịch chiết Lá khơi trong hình 3.4 cho thấy, dịch chiết Lá khôi ở nồng độ 75µg/ml đã làm giảm mạnh số lượng tumorsphere cũng như kích thước các tumorsphere. Cụ thể so với mẫu đối chứng sau 48h xử lý, số lượng các khối cầu giảm 50%, kích thước các khối cầu cũng giảm khoảng 80% so với mẫu đối chứng. Thêm vào đó, hình thái tumorsphere ở mẫu xử lý đã bị biến đổi mạnh, các khối cầu bị phân rã thành các tế bào đơn. Điều này cũng đồng nghĩa là khi xử lý với dịch chiết Lá khơi đã thay đổi đặc tính phân chia, tăng sinh của tế bào trong các tumorsphere. Như vậy, dịch chiết Lá khôi đã tác động rõ rệt lên sự sinh trưởng và phát triển của các tumorsphere.

3.5. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên chu kỳ tế bào

Để thực hiện mục tiêu trọng tâm của đề tài là đánh giá sự tác động của dịch chiết Lá khôi lên các pha của chu kỳ tế bào ung thư dạ dày. Các tumorsphere sau 48h xử lý với dịch chiết Lá khơi ở nồng độ 75µg/ml được thu nhận và phân tách thành các tế bào đơn, sau đó phân tích chu kỳ tế bào bằng hệ thống Flow cytometry. Kết quả phân tích chu kỳ tế bào được trình bày trong hình 3.5 dưới đây.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Kết quả hình 3.5 chỉ ra rằng, dịng tế bào MKN45 được xử lý với dịch chiết Lá khơi có sự tích lũy cao các tế bào tại pha G0/ G1. Dòng tế bào ung thư này sau khi được xử lý với dịch chiết Lá khôi đã giảm mạnh ở pha S và pha G2/M nhưng lại có tăng tỷ lệ các tế bào phase G0/ G1 lên tới 63,3% so với đối chứng là 46,7%. Như vậy, sự ức chế phân chia tế bào của dòng tế bào MKN45 có thể được giải thích bởi sự dừng chu kỳ tế bào ở pha G0/ G1 – pha nghỉ giữa 2 lần phân chia tế bào. Pha này đặc trưng cho các tế bào ở trạng thái biệt hóa hoặc lão hóa. Rất có thể dịch chiết Lá khơi đã cảm ứng q trình già hóa, biệt hóa tế bào gốc ung thư dạ dày và làm dừng sự tăng trưởng của tế bào ung thư MKN45.

Hình 3.5. Dịch chiết Lá khơi tác động lên chu kỳ tế bào của tế bào trong các

tumorsphere. Thang đo 50 µm

Năm 2014, Aeyung Kim và cộng sự cũng nghiên cứu về ảnh hưởng của KIOM-C (là hợp chất chiết xuất từ các cây thuốc thảo dược bao gồm: Radix

Scutellariae, Radix Glycyrrhizae, Radix Paeoniae alba, Radix Angelicae

gigantis, Grandiflorum, Zingiber officinale và Lonicera japonica) đến khả

năng gây chết tế bào ung thư và làm sáng tỏ các cơ chế chống ung thư tiềm ẩn. Phân tích chu trình tế bào cho thấy, xử lý KIOM-C trong 12h và 24h đã tăng tỷ lệ tế bào trong pha G1 lên 57,14 và 55,53%, so với tế bào đối chứng không được xử lý (36,69%). Sự tăng pha G1 này đi kèm với sự giảm tương ứng tỷ lệ các tế bào trong các pha S và G2/M. Phân nhóm apoptotic G0/G1 đỉnh đã tăng đáng kể khi xử lý bằng KIOM-C lên 7,92 và 13,96% sau khi ủ 12h và 24h so với các tế bào đối chứng (3,24%), cho thấy việc ngừng chu kỳ tế bào G1 do KIOM-C gây ra đã làm chậm quá trình tăng trưởng và sau đó gây ra q trình apoptosis [15]. Năm 2016, tác giả JIN ZHOU và cộng sự cũng nghiên cứu về tác dụng của hợp chất Quercetin, là một hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật lên các tế bào HepG2 bằng cách cho các tế bào

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn HepG2 được xử lý với 50 Quercetin trong 24h, 48h hoặc 72h và phân tích chu kỳ tế bào bằng phương pháp Flow cytometry. Kết quả, chu kỳ tế bào của HepG2 đã thay đổi đáng kể sau khi xử lý với nồng độ Quercetin phù hợp; tỷ lệ tế bào trong pha G0/G1 tăng lên và những tế bào trong pha S giảm dần so với các tế bào HepG2 đối chứng. Như vậy, Quercetin có thể gây ra sự dừng pha G1 trong các tế bào HepG2. Dựa trên các quan sát đã nói ở trên, người ta cho rằng Quercetin thực hiện hoạt động chống ung thư trong các tế bào HepG2 thông qua nhiều con đường, bao gồm can thiệp vào biểu hiện gen CCND1 để phá vỡ chu kỳ tế bào và tăng sinh của tế bào HepG2 [37]. Gần đây, tác giả Ho Jeong Lee và cộng sự đã nghiên cứu Pectolinarigenin, một flavonoid tự nhiên có trong Cirsium chanroenicum. Trong nghiên cứu này đã chỉ ra cơ chế chống ung thư của Pectolinarigenin là làm chết tế bào gây ra bởi bệnh autophagy và apoptosis trong tế bào ung thư dạ dày AGS và MKN28 ở người. Hơn nữa, việc xử lý Pectolinarigenin đã làm giảm tỷ lệ phần trăm của pha G1 và tăng các tế bào pha G1 và G2/M. Nghiên cứu này đã làm sáng tỏ cơ chế chống ung thư mới của PEC đối với dòng tế bào ung thư dạ dày AGS và MKN28 ở người bằng việc làm dừng pha G2/M, quá trình apoptosis trong in

vitro [34].

AG36 là sản phẩm biến đổi sinh học của Triterpenoid saponin từ cây Lá khôi (Ardisia gigantifolia Stapf). AG36 làm giảm sự biểu hiện protein của các protein quy định chu kỳ cyclin B1 hoặc cyclin D1. Trong các tế bào MCF-7 và MDA-MB-231, AG36 đã tăng cường biểu hiện protein caspase-3 và caspase-8, trong khi đó ở các tế bào SK-BR-3, AG36 chỉ làm tăng sự biểu hiện protein của caspase-3. Các nghiên cứu in vivo cho thấy, AG36 ức chế

đáng kể sự phát triển của khối u xenograft MCF-7 ở chuột nhắt BALB/c so với mẫu đối chứng [51].

3.6. Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA

Để đánh giá tác động của dịch chiết Lá khôi lên sự biểu hiện của các gen kiểm soát chu kỳ tế bào của tế bào gốc ung thư dạ dày. RNA tổng số từ các tế bào đối chứng không xử lý với dịch chiết Lá khôi và tế bào xử lý với dịch

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn chiết Lá khôi đã được tách chiết và tinh sạch bằng phương pháp Trizol. Kết quả tách chiết được biểu thị trong hình 3.6.

RNA tổng số được tách chiết từ các tế bào ung thư dạ dày thu nhận sau q trình ni cấy được định lượng bằng máy đo quang phổ NanoDrop ở bước sóng hấp thụ 260 nm đối với acid nucleic và bước sóng hấp thụ 280nm đối với protein. Kết quả được thể hiện ở hình 3.6 và bảng 3.1.

Hình 3.6. Phổ hấp thụ của RNA tổng số tách chiết từ các tumorsphere Bảng 3.1. Nồng độ RNA từ mẫu đối chứng và mẫu xử lý Bảng 3.1. Nồng độ RNA từ mẫu đối chứng và mẫu xử lý

Kết quả trong hình 3.6 và bảng 3.1 cho thấy, phổ hấp thụ huỳnh quang của các mẫu RNA tổng số đã cho thấy, RNA thu được có độ tinh sạch cao, thể hiện qua giá trị 260/280 của tất cả các mẫu đối chứng (Control) và mẫu xử lý với dịch chiết Lá khơi (LK 75µg/ml từ 1-3) đều trong khoảng từ 1,87 – 1,94 đáp ứng tốt cho các phản ứng PCR. Hơn nữa, RNA của các mẫu thu được đều có hàm lượng cao thể hiện ở hàm lượng từ 212,7 đến 560,4ng/µl. Từ nồng độ này, qua tính tốn chúng tơi đã sử dụng lượng RNA là 1µg để tổng hợp lên cDNA phục vụ cho phân tích Realtime-PCR trong các nghiên cứu tiếp theo.

3.7. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên các gen của tế bào gốc ung thư

Như đã giới thiệu trong phần tổng quan, trong quần thể tế bào ung thư, các tế bào gốc có chức năng phân chia, tăng sinh và biệt hóa tế bào. Chính vì vậy, trước khi tiến hành đánh giá tác động của dịch chiết Lá khôi lên chu kỳ tế bào, chúng tơi đánh giá ảnh hưởng của nó lên các gen đặc trưng của tế bào gốc ung thư dạ dày. Các gen được lựa chọn để phân tích là các gen marker tế bào gốc (CD44 và ALDH) và gen tự làm mới tế bào (SOX2). Kết quả phân tích biểu hiện gen bằng Realtime PCR được trình bày trong hình 3.7.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.7. Dịch chiết Lá khôi tác động lên sự biểu hiện các gen mã hóa cho

marker tế bào gốc (CD44 và ALDH) và gen tự làm mới tế bào (SOX2) Quan sát hình 3.7 cho thấy rằng, dịch chiết Lá khơi đã làm giảm rõ rệt mức độ biểu hiện của CD44 và SOX2. Trong đó, mức độ giảm biểu hiện mạnh nhất là ở gen SOX2 với mức giảm thiểu khoảng 50%, sau đó đến CD44 mức độ biểu hiện giảm khoảng 30%. Tuy nhiên, gen ALDH khơng có sự thay đổi rõ rệt về mức độ biểu hiện mRNA giữa các tế bào MKN45 xử lý với dịch chiết Lá khôi và mẫu đối chứng được xử lý với DMSO nồng độ 0,01% trong thời gian tương ứng.

CD44 là một phân tử bề mặt tế bào đa cấu trúc và đa chức năng liên quan đến sự tăng sinh tế bào, biệt hóa tế bào, di chuyển tế bào, tạo mạch… [60]. Năm 2015, Anasuya Ray và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt động ức chế của hợp chất 6-shogaol có nguồn gốc từ Gừng (Zingiber officinale) chống lại các tế bào ung thư vú và nhận thấy rằng, 6-shogaol có hiệu quả trong việc tiêu diệt cả tế bào đơn nhân ung thư vú. Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang đã cho thấy, sau khi được xử lý với 6-shogaol biểu hiện của CD44 cao hơn đáng kể với các tế bào MCF-7 khơng được xử lý với 6-shogaol. Đồng thời, phân tích Flow cytometry cũng cho thấy, CD44 tăng cao trong các tế bào hình cầu so với các tế bào đối chứng [22]. Năm 2017, hai tác giả Emika Ohkoshi và Naoki Umemura đã nghiên cứu về Baicalein - một trong những thành phần chính trong rễ cây

Scutellaria. Họ đã kiểm tra xem các thành phần thuốc thảo dược có ảnh hưởng

đến biểu hiện CD44 và gây ra apoptosis tế bào ung thư như thế nào. Kết quả là Baicalin tăng cường apoptosis không ảnh hưởng đến nồng độ CD44, trong khi Baicalein không tăng cường apoptosis và điều hịa CD44 trong ung thư biểu mơ tế bào vảy ở đầu và cổ. Hơn nữa, Baicalein gây ra sự phosphoryl hóa CHK1, như một dấu hiệu phản ứng phá hủy DNA đối với việc dừng pha G2/M. Kết quả này đã chứng minh rõ ràng rằng, Baicalein tăng cường biểu hiện của CD44 và theo đó tăng cường phản ứng phá hủy DNA. Những dữ liệu này cho thấy rằng, cảm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ứng CD44 đã ức chế tế bào ung thư gây ra apoptosis bằng cách tăng phản ứng phá hủy DNA [27]. Gần đây, Daliang Chen và cộng sự cũng đã nghiên cứu tác động của Galangin (3,5,7 trihydroxyflavone), một loại flavonoid tự nhiên có trong thực vật có thể ức chế EMT, sự hình thành mạch và biểu hiện CD44 trong bệnh u thần kinh đệm. Họ quan sát thấy rằng, Galangin ức chế sự tăng sinh, di cư, xâm lấn và tạo mạch của các tế bào u thần kinh đệm bằng cách phụ thuộc vào liều lượng, ức chế sự biểu hiện của CD44 và ức chế sự hình thành mạch của các tế bào glioma thông qua yếu tố tăng trưởng nội mơ mạch máu. Ngồi ra, sự biểu hiện quá mức của CD44 trong các tế bào U87 và U251 đã xóa bỏ một phần ảnh hưởng của Galangin đối với các tế bào u thần kinh đệm. Những kết quả này chỉ ra rằng, Galangin là một loại thuốc mới tiềm năng để điều trị u nguyên bào thần kinh đệm do khả năng ức chế CD44, EMT và sự hình thành mạch. Kết quả này cũng chứng minh rằng, Galangin giảm mức độ mRNA và protein của CD44, Snail, vimentin và ZEB1 [24].

SOX2 là một yếu tố phiên mã rất cần thiết để duy trì khả năng tự đổi mới, hoặc đa năng của các tế bào gốc phơi khơng biệt hố. SOX2 có vai trị quan trọng trong việc duy trì tế bào gốc phơi và tế bào thần kinh [32]. Năm 2016, Zhang và cộng sự đã nghiên cứu về Cryptotanshinone (CT), một loại thuốc thảo dược truyền thống của Trung Quốc. Kết quả chứng minh rằng, sử dụng CT làm thay đổi sự tăng sinh tế bào, tình trạng chu kỳ tế bào, di cư, khả năng sống, sự hình thành khuẩn lạc và đáng chú ý là sự hình thành khối cầu và điều chỉnh giảm các gen (Nanog, OCT4, SOX2, β-catenin, CXCR4). Cụ thể là CT làm giảm mức độ biểu hiện của một số gen nhất định trong tế bào, đặc biệt là biểu hiện của Nanog, BMI1 và catenin. Mức giảm mRNA đáng kể về mặt thống kê đã được quan sát ở 5 nhóm điều trị CT. Điều trị CT làm giảm mức độ biểu hiện protein Nanog, SOX2 và OCT4 bằng cách phụ thuộc vào tổng số tế bào và các tế bào hình cầu [85]. Năm 2018, Zhen-Fei Wang và cộng sự đã nghiên cứu tác động của Astragaloside IV (được phân lập từ Radix Astragali là một loại thảo dược

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ngừa GCAFs, điều chỉnh tăng các yếu tố gây ung thư SOX2 và NANOG trong các tế bào ung thư dạ dày [86]. Năm 2018, Lan Thị Hạnh Phi và cộng sự đã nghiên cứu tác động của hợp chất Ginsenoside Rb2, một saponin từ Nhân sâm

Panax lên tế bào ung thư đại trực tràng. Kết quả cho thấy rằng, Ginsenoside Rb2

đã ức chế đáng kể biểu hiện của SOX2. Những kết quả này cho thấy, Ginsenoside Rb2 ức chế các đặc tính giống như tế bào gốc thông qua SOX2. Đặc biệt, chứng minh rằng việc kích hoạt EGFR gây ra biểu hiện SOX2 và ngược lại, SOX2 liên kết với EGFR làm tăng mức độ biểu hiện EGFR và do đó, hình thành mối quan hệ phản hồi tích cực giữa EGFR và SOX2 [50].

ALDH là một marker của tế bào gốc ung thư trong nhiều typ ung thư khác nhau như: ung thư ruột, ung thư buồng trứng, ung thư gan. Một nghiên cứu gần đây của Nguyễn Phú Hùng và cs tại đã xác định ALDH là một marker đặc trưng của tế bào gốc ung thư dạ dày [6]. Tetrandrine là một alcaloid bcdenzylisoquinoline được tìm thấy trong Stephania tetrandra. Hợp chất này đã được tác giả Wei Xu và cộng sự nghiên cứu tác động của nó lên tế bào ung thư vú năm 2011 và đã kết luận rằng, Tetrandrine làm giảm số lượng ALDH+. Điều này có nghĩa là Tetrandrine ức chế các tế bào dương tính với

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu tác động của dịch chiết lá khôi (ardisia gigantifolia stapf ) lên sự biểu hiện của các gen kiểm soát chu kỳ tế bào của tế bào gốc ung thư dạ dày​ (Trang 39)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(62 trang)