Bảng 3.1. Nồng độ RNA từ mẫu đối chứng và mẫu xử lý
Kết quả trong hình 3.6 và bảng 3.1 cho thấy, phổ hấp thụ huỳnh quang của các mẫu RNA tổng số đã cho thấy, RNA thu được có độ tinh sạch cao, thể hiện qua giá trị 260/280 của tất cả các mẫu đối chứng (Control) và mẫu xử lý với dịch chiết Lá khơi (LK 75µg/ml từ 1-3) đều trong khoảng từ 1,87 – 1,94 đáp ứng tốt cho các phản ứng PCR. Hơn nữa, RNA của các mẫu thu được đều có hàm lượng cao thể hiện ở hàm lượng từ 212,7 đến 560,4ng/µl. Từ nồng độ này, qua tính tốn chúng tơi đã sử dụng lượng RNA là 1µg để tổng hợp lên cDNA phục vụ cho phân tích Realtime-PCR trong các nghiên cứu tiếp theo.
3.7. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên các gen của tế bào gốc ung thư
Như đã giới thiệu trong phần tổng quan, trong quần thể tế bào ung thư, các tế bào gốc có chức năng phân chia, tăng sinh và biệt hóa tế bào. Chính vì vậy, trước khi tiến hành đánh giá tác động của dịch chiết Lá khôi lên chu kỳ tế bào, chúng tơi đánh giá ảnh hưởng của nó lên các gen đặc trưng của tế bào gốc ung thư dạ dày. Các gen được lựa chọn để phân tích là các gen marker tế bào gốc (CD44 và ALDH) và gen tự làm mới tế bào (SOX2). Kết quả phân tích biểu hiện gen bằng Realtime PCR được trình bày trong hình 3.7.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.7. Dịch chiết Lá khơi tác động lên sự biểu hiện các gen mã hóa cho
marker tế bào gốc (CD44 và ALDH) và gen tự làm mới tế bào (SOX2) Quan sát hình 3.7 cho thấy rằng, dịch chiết Lá khơi đã làm giảm rõ rệt mức độ biểu hiện của CD44 và SOX2. Trong đó, mức độ giảm biểu hiện mạnh nhất là ở gen SOX2 với mức giảm thiểu khoảng 50%, sau đó đến CD44 mức độ biểu hiện giảm khoảng 30%. Tuy nhiên, gen ALDH khơng có sự thay đổi rõ rệt về mức độ biểu hiện mRNA giữa các tế bào MKN45 xử lý với dịch chiết Lá khôi và mẫu đối chứng được xử lý với DMSO nồng độ 0,01% trong thời gian tương ứng.
CD44 là một phân tử bề mặt tế bào đa cấu trúc và đa chức năng liên quan đến sự tăng sinh tế bào, biệt hóa tế bào, di chuyển tế bào, tạo mạch… [60]. Năm 2015, Anasuya Ray và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt động ức chế của hợp chất 6-shogaol có nguồn gốc từ Gừng (Zingiber officinale) chống lại các tế bào ung thư vú và nhận thấy rằng, 6-shogaol có hiệu quả trong việc tiêu diệt cả tế bào đơn nhân ung thư vú. Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang đã cho thấy, sau khi được xử lý với 6-shogaol biểu hiện của CD44 cao hơn đáng kể với các tế bào MCF-7 khơng được xử lý với 6-shogaol. Đồng thời, phân tích Flow cytometry cũng cho thấy, CD44 tăng cao trong các tế bào hình cầu so với các tế bào đối chứng [22]. Năm 2017, hai tác giả Emika Ohkoshi và Naoki Umemura đã nghiên cứu về Baicalein - một trong những thành phần chính trong rễ cây
Scutellaria. Họ đã kiểm tra xem các thành phần thuốc thảo dược có ảnh hưởng
đến biểu hiện CD44 và gây ra apoptosis tế bào ung thư như thế nào. Kết quả là Baicalin tăng cường apoptosis không ảnh hưởng đến nồng độ CD44, trong khi Baicalein không tăng cường apoptosis và điều hịa CD44 trong ung thư biểu mơ tế bào vảy ở đầu và cổ. Hơn nữa, Baicalein gây ra sự phosphoryl hóa CHK1, như một dấu hiệu phản ứng phá hủy DNA đối với việc dừng pha G2/M. Kết quả này đã chứng minh rõ ràng rằng, Baicalein tăng cường biểu hiện của CD44 và theo đó tăng cường phản ứng phá hủy DNA. Những dữ liệu này cho thấy rằng, cảm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ứng CD44 đã ức chế tế bào ung thư gây ra apoptosis bằng cách tăng phản ứng phá hủy DNA [27]. Gần đây, Daliang Chen và cộng sự cũng đã nghiên cứu tác động của Galangin (3,5,7 trihydroxyflavone), một loại flavonoid tự nhiên có trong thực vật có thể ức chế EMT, sự hình thành mạch và biểu hiện CD44 trong bệnh u thần kinh đệm. Họ quan sát thấy rằng, Galangin ức chế sự tăng sinh, di cư, xâm lấn và tạo mạch của các tế bào u thần kinh đệm bằng cách phụ thuộc vào liều lượng, ức chế sự biểu hiện của CD44 và ức chế sự hình thành mạch của các tế bào glioma thông qua yếu tố tăng trưởng nội mơ mạch máu. Ngồi ra, sự biểu hiện quá mức của CD44 trong các tế bào U87 và U251 đã xóa bỏ một phần ảnh hưởng của Galangin đối với các tế bào u thần kinh đệm. Những kết quả này chỉ ra rằng, Galangin là một loại thuốc mới tiềm năng để điều trị u nguyên bào thần kinh đệm do khả năng ức chế CD44, EMT và sự hình thành mạch. Kết quả này cũng chứng minh rằng, Galangin giảm mức độ mRNA và protein của CD44, Snail, vimentin và ZEB1 [24].
SOX2 là một yếu tố phiên mã rất cần thiết để duy trì khả năng tự đổi mới, hoặc đa năng của các tế bào gốc phơi khơng biệt hố. SOX2 có vai trị quan trọng trong việc duy trì tế bào gốc phơi và tế bào thần kinh [32]. Năm 2016, Zhang và cộng sự đã nghiên cứu về Cryptotanshinone (CT), một loại thuốc thảo dược truyền thống của Trung Quốc. Kết quả chứng minh rằng, sử dụng CT làm thay đổi sự tăng sinh tế bào, tình trạng chu kỳ tế bào, di cư, khả năng sống, sự hình thành khuẩn lạc và đáng chú ý là sự hình thành khối cầu và điều chỉnh giảm các gen (Nanog, OCT4, SOX2, β-catenin, CXCR4). Cụ thể là CT làm giảm mức độ biểu hiện của một số gen nhất định trong tế bào, đặc biệt là biểu hiện của Nanog, BMI1 và catenin. Mức giảm mRNA đáng kể về mặt thống kê đã được quan sát ở 5 nhóm điều trị CT. Điều trị CT làm giảm mức độ biểu hiện protein Nanog, SOX2 và OCT4 bằng cách phụ thuộc vào tổng số tế bào và các tế bào hình cầu [85]. Năm 2018, Zhen-Fei Wang và cộng sự đã nghiên cứu tác động của Astragaloside IV (được phân lập từ Radix Astragali là một loại thảo dược
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ngừa GCAFs, điều chỉnh tăng các yếu tố gây ung thư SOX2 và NANOG trong các tế bào ung thư dạ dày [86]. Năm 2018, Lan Thị Hạnh Phi và cộng sự đã nghiên cứu tác động của hợp chất Ginsenoside Rb2, một saponin từ Nhân sâm
Panax lên tế bào ung thư đại trực tràng. Kết quả cho thấy rằng, Ginsenoside Rb2
đã ức chế đáng kể biểu hiện của SOX2. Những kết quả này cho thấy, Ginsenoside Rb2 ức chế các đặc tính giống như tế bào gốc thông qua SOX2. Đặc biệt, chứng minh rằng việc kích hoạt EGFR gây ra biểu hiện SOX2 và ngược lại, SOX2 liên kết với EGFR làm tăng mức độ biểu hiện EGFR và do đó, hình thành mối quan hệ phản hồi tích cực giữa EGFR và SOX2 [50].
ALDH là một marker của tế bào gốc ung thư trong nhiều typ ung thư khác nhau như: ung thư ruột, ung thư buồng trứng, ung thư gan. Một nghiên cứu gần đây của Nguyễn Phú Hùng và cs tại đã xác định ALDH là một marker đặc trưng của tế bào gốc ung thư dạ dày [6]. Tetrandrine là một alcaloid bcdenzylisoquinoline được tìm thấy trong Stephania tetrandra. Hợp chất này đã được tác giả Wei Xu và cộng sự nghiên cứu tác động của nó lên tế bào ung thư vú năm 2011 và đã kết luận rằng, Tetrandrine làm giảm số lượng ALDH+. Điều này có nghĩa là Tetrandrine ức chế các tế bào dương tính với ALDH ở nồng độ tương tự [81]. Năm 2012, Qing-An Jia và cộng sự đã nghiên cứu về tác động của hợp chất Songyou Yin (một loại thuốc truyền thống của Trung Quốc) lên ung thư biểu mô tế bào gan và đã cho kết luận rằng, Songyou Yin làm giảm biểu hiện của CD90, ABCG2, ALDH, CD44, EPCAM, vimentin và MMP-9 và tăng biểu hiện của E-cadherin, trong các tế bào ung thư biểu mô tế bào gan sau khi điều trị kết hợp [66].
Kết quả nghiên cứu này chỉ ra rằng, dịch chiết Lá khôi đã tác động là giảm sự biểu hiện của 2 trong số 3 gen chủ chốt của tế bào gốc ung thư được phân tích.
3.8. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên các gen kiểm soát chu kỳ tế bào
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Để nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết Lá khơi lên các gen kiểm sốt chu kỳ tế bào. Chúng tơi tiến hành phân tích ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên sự phiên mã của 5 gen kiểm soát chu kỳ tế bào chính gồm: P21, P27, CCND1, CCNE1, PCNA. Các phản ứng PCR đã được thực hiện với các cặp mồi đặc hiệu tương ứng với 5 gen do Quiagene cung cấp. Kết quả biểu hiện gen giữa các mẫu đối chứng và mẫu được xử lý với dịch chiết Lá khơi được trình bày dưới dạng biểu đồ ở hình 3.8. Kết quả phân tích ở biểu đồ hình 3.8 cho thấy, sau khi xử lí với dịch chiết Lá khơi, các gen P21 và CCNE1 có sự thay đổi biểu hiện ở mức độ phiên mã. Ngược lại, các gen P27, CDND1, PCNA khơng có sự thay đổi đáng kể.
Hình 3.8. Dịch chiết Lá khơi tác động lên các gen kiểm soát chu kỳ phân chia
của tế bào
Trong nghiên cứu này, hai gen P21 và CCNE1 được chúng tôi lựa chọn để nghiên cứu sự ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên sự biểu hiện gen ở mức độ phiên mã. Nhìn vào kết quả ở hình 3.8 ta thấy, dưới tác dụng của dịch chiết Lá khôi mức độ biểu hiện mRNA của P21 tăng mạnh khoảng 5 lần so với mẫu đối chứng. Kết quả phân tích cũng cho thấy, sự biểu hiện của gen CCNE1 ở mức độ phiên mã bị giảm đi đáng kể khi chịu tác động của dịch chiết Lá khôi. CCNE1 là gen mã hóa cho protein Cyclin-E1 đặc hiệu G1/S [46]. Trước đó, các nghiên cứu khác nhau đã đề cập đến khả năng áp chế sự biểu hiện của P21 và các một số gen kiểm soát chu kỳ tế bào của một số hợp chất từ thực vật. Điển hình như, E-Chu Huang và cộng sự đã nghiên cứu tác động của Zyflamend, một hỗn hợp chiết xuất của 10 loại thảo dược lên tế bào ung thư tuyến tiền liệt. Kết quả cho thấy, Zyflamend đã cảm ứng của các chất ức chế chu kỳ tế bào P21 ở mức độ mRNA và protein. Kết quả là, trong các tế bào CWR22Rv1, Zyflamend làm cho nồng độ protein của P21 tăng gấp 2,4 lần so với đối chứng [25]. Cùng năm 2014, tác giả Ruowen Zhang và cộng sự đã thực hiện
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn nghiên cứu về tác động của Yuanhuacine (YHL-14), thành phần chính của daphnane diterpene ester phân lập từ nụ hoa của Daphne genkwa. Việc tác động các tế bào bằng YHL-14 không gây ra hiệu quả rõ rệt đối với quá trình apoptosis của tế bào, nhưng nó đã gây ra sự dừng pha G2/M ở cả tế bào T24T và HCT116, cho thấy rằng dừng pha G2/M có thể liên quan đến hiệu ứng chống ung thư của YHL-14. Do P21 là chất ức chế chu kỳ tế bào quan trọng liên quan đến điều hòa chu kỳ tế bào, nên tác dụng của YHL-14 đối với biểu hiện P21 và biểu hiện của yếu tố phiên mã ngược dịng của nó được đánh giá trong cả tế bào T24T và HCT116. Kết quả sau khi xử lý bằng YHL-14 trong 12h, biểu hiện protein P21 được điều chỉnh tăng đáng kể ở cả tế bào T24T và HCT116 [69]. Năm 2017, tác giả Hyun-Woo Lee và cộng sự đã chứng minh tác dụng của Celastrol, một triterpene được chiết xuất từ vỏ rễ của từ rễ cây Trypterigium wilfordii đối với bệnh ung thư dạ dày. Kết quả cho thấy, sự biểu hiện của các protein liên quan đến chu trình tế bào, như P21 và P27 đã tăng lên rõ rệt và biểu hiện của cyclin D1 đã giảm khi tác động bằng celastrol từ nồng độ 0,25 μM đến 1 μM [35]. Cũng trong năm 2017, Bing Hu và cộng sự đã tìm hiểu về hợp chất Teng-Long-Bu-Zhong-Tang là một công thức thảo dược của Trung Quốc để điều trị ung thư biểu mô đại trực tràng. Teng-Long- Bu-Zhong-Tang có hiệu quả gây ra lão hóa tế bào trong ung thư biểu mô đại trực tràng, kèm theo sự điều hòa P21. Trong nghiên cứu này, tác giả đã đánh giá liệu sự lão hóa tế bào do Teng-Long-Bu-Zhong-Tang có liên quan đến P21 hay khơng, phân tích P21 bởi siRNA cụ thể đã loại bỏ đáng kể sự lão hóa tế bào do Teng-Long-Bu-Zhong-Tang gây ra. Những quan sát này cho thấy sự lão hóa tế bào do Teng-Long-Bu-Zhong-Tang gây ra phụ thuộc vào P21. Sự biểu hiện P21 đã giảm đi bằng cách can thiệp RNA và làm suy giảm đáng kể sự lão hóa tế bào do Teng-Long-Bu-Zhong-Tang gây ra trong các tế bào ung thư đại trực tràng LS174T ở người [19].
Trong nghiên cứu này, kết quả phân tích cho thấy, sự biểu hiện ở mức độ phiên mã của các gen P27, CCND1, PCNA không chịu ảnh hưởng của dịch
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn chiết Lá khôi. P27 được coi là một chất ức chế khối u vì chức năng của nó như là một bộ điều chỉnh chu kỳ tế bào. Trong các bệnh ung thư, P27 thường bị bất hoạt thông bị suy yếu hoặc sai lệch vị trí [23]. Năm 2013, Aeyung Kim và cộng sự đã nghiên cứu về tác động của Samsoeum (SSE), một công thức thảo dược truyền thống của Trung Quốc lên các tế bào ung thư. Trong quá trình điều trị SSE sớm, tác giả đưa ra kết luận rằng, các tế bào đã dừng pha G2/M đồng thời với sự điều hòa tăng của P21 và P27 và điều hòa giảm của cyclin D1 và cyclin B1, sau đó là sự gia tăng các tế bào YO-PRO-1 (+) apoptotic [16]. Nghiên cứu ảnh hưởng của KIOM-C đến sự biểu hiện của protein điều hòa pha G1 của P21, P27 và cyclin D1 cho thấy điều trị KIOM-C điều chỉnh tăng mức độ của các chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin P21 và P27, trong khi nó điều chỉnh giảm mức độ của cyclin D1, so với các tế bào đối chứng [15]. Trong quá trình phát triển của các khối u, cyclins loại D đóng vai trị trung tâm trong q trình chuyển đổi chu kỳ tế bào. Các nghiên cứu gần đây đã tập trung vào mối tương quan giữa CCND1 và các bệnh ác tính, như ung thư dạ dày và ung thư vú. Những thay đổi trong biểu hiện CCND1 đã được quan sát trong các tế bào ung thư gan sau khi điều trị bằng Quercetin đã cho kết quả như sau, có ba peptide chứa Leu của CCND1 được phát hiện và điểm MS là xấp xỉ 158. Mức độ biểu hiện protein trung bình của CCND1 đã giảm xuống 0,55 sau khi điều trị bằng Quercetin. Mức độ biểu hiện RNA và protein của CCND1 đã giảm liên tục trong các tế bào HepG2 khi tiếp xúc với 50 quercetin trong 48h [37].
3.9. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên sự biểu hiện của protein P21
Sự tăng cường phiên mã của gen P21 có ý nghĩa rất quan trọng trong sự hoạt hóa con đường tín hiệu lão hóa tế bào. Để đánh giá tác động của chiết Lá khôi lên sự biểu hiện của P21 ở mức độ protein, chúng tôi đã sử dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang với kháng thể đơn dòng kháng P21. Kết quả thu được, được trình bày trong hình 3.9.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.9. Dịch chiết Lá khôi tác động lên sự biểu hiện của protein kiểm soát