3. Nội dung nghiên cứu
1.3.3. Các nghiên cứu về tác dụng của cây Lá khôi trong điều trị ung thư
Theo nghiên cứu của Mu L và cộng sự năm 2014 thì chiết xuất etanolic của rễ loài Ardisia gigantifolia (AGB-5) (Trung Quốc), có thể ảnh hưởng đến sự tăng sinh của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú ở người (MCF-7) trong ống nghiệm và khám phá tế bào ung thư dưới tác dụng của AGB-5 trên chuột
được ghép với các tế bào MCF-7. Trong một mô hình in vivo, AGB-5 đã giảm thể tích khối u, mang lại tế bào hồng cầu và tế bào bạch cầu gần bằng giá trị bình thường, tăng cường superoxide disutase và catalase của chuột mang MCF-7. Đây là nghiên cứu đầu tiên xác minh hoạt động chống ung thư của A.
gigantifolia in vivo. Kết quả cho thấy, AGB-5 có thể có tác dụng có lợi đối
với ung thư biểu mô tuyến vú ở người [53].
AG36 là sản phẩm biến đổi sinh học của triterpenoid saponin từ Ardisia gigantifolia. Năm 2017, tác giả Li-Hua Mu và cộng sự đã chỉ ra hoạt động chống ung thư và các cơ chế phân tử cơ bản của AG36 chống lại các tế bào ung thư vú MCF-7, MDA-MB và SK-BR-3 ở người. Các nghiên cứu in vivo cho thấy AG36 ức chế đáng kể sự phát triển của khối u MCF-7 ở chuột so với đối chứng. Cụ thể, AG36 ức chế sự tăng sinh tế bào MCF-7, MDA-MB-SK và SK-BR-3. Vì vậy, AG36 có thể là một tác nhân điều trị ung thư vú tiềm năng [51].
Hợp chất 1, một saponin triterpenoid từ Ardisia gigantifolia cho thấy hoạt động chống khối u tiềm năng, gồm có 3 dẫn xuất (2-4). Trong số đó, hợp chất 2 và 3 là hợp chất mới. Các hợp chất 3 được đánh giá về khả năng gây độc tế bào đối với ung thư biểu mô tế bào gan và tế bào gan bình thường. Hợp chất 3 cho thấy độc tính tế bào tốt hơn đối với các dòng tế bào Bel-7402 và HepG2 và độc tính tế bào yếu hơn nhiều so với tế bào L02 gan bình thường so với kiểm soát dương tính [58].
Ba triterpenoid saponin mới, 1- 3, cùng với hai saponin được biết đến, 4 và 5, đã được phân lập từ thân rễ của Ardisia gigantifolia. Kết cấu của chúng được làm sáng tỏ bằng các nghiên cứu quang phổ NMR 1D và 2D. Saponin 1, 2, 4, và 5 có tính độc tế bào đáng kể đối với bốn dòng tế bào ung thư của người, như tế bào ung thư cổ tử cung Hela, tế bào u ác tính EJ, tế bào gan hepatoma và các tế bào ung thư dạ dày BCG ở người [56].
Hợp chất 1, một saponin triterpenoid từ Ardisia gigantifolia cho thấy hoạt động chống khối u tiềm năng, đã bị thủy phân thành hai dẫn xuất
deglycosyl (2 và 3) bởi Alternaria Alternata AS 3.6872. Cả hai dẫn xuất này là các hợp chất mới. Cấu trúc của chúng đã được làm rõ trên cơ sở dữ liệu quang phổ xoay 1D, 2D NMR, HR-ESI-MS và quang học. Các hợp chất 1-3 được đánh giá về khả năng gây độc tế bào chống lại ung thư tế bào gan và tế bào gan bình thường [59].
Mười ba 13,28-epoxy triterpenoid saponin đã được phân lập từ cây Lá khôi và một saponin có tiềm năng chống khối u đã được methyl hóa bởi H2SO4 để tạo ra bốn hợp chất mới. Phân tích mối quan hệ cấu trúc và hoạt động chỉ ra rằng sự kết hợp của nhóm O tại C-16, L-rhamnose tại R (5) và nhóm acetyl ở OH-6 của D-glucose dẫn đến tăng đáng kể hoạt tính gây độc trên A549 và HCT-8 nhưng làm giảm đáng kể hoạt tính gây độc tế bào trên các tế bào Bel-7402 [55].
Mức độ ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên apoptosis 3 dòng tế bào (AGS, MKN45, MKN74) khác nhau, cụ thể như sau: Tỷ lệ apoptosis ở dòng AGS là 11,5 ± 5,2% cao nhất trong 3 dòng, tiếp theo là dòng MKN45 với tỷ lệ 6,5 ± 0,5%; thấp nhất ở dòng MKN74 với tỷ lệ 3,3 ± 1,1%. Như vậy, mặc dù ở nồng độ 100 µg là một nồng độ có khả năng ức chế 70 – 80% khả năng sinh trưởng của tế bào nhưng khả năng cảm ứng apoptosis đối với cả 3 dòng tế bào chỉ đạt từ 3,3 – 11,5%; đây là một tỷ lệ rất thấp so với một số nghiên cứu khác. Kết quả này chỉ ra rằng dịch chiết Lá khôi là ít độc cho các tế bào và khả năng ức chế cao sự phân chia nhưng ít gây ra apoptosis, đó có thể là do một cơ chế sinh học khác như sự biệt hóa tế bào gốc, sự già hóa [7].
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
Dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45, do Phòng thí nghiệm Inserm U1053 - Viện Sức khỏe và Nghiên cứu Y học Quốc gia - Cộng hòa Pháp cung cấp, được lưu trữ tại phòng Thí nghiệm Y - Sinh - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại Khoa học - Đại học Thái Nguyên.
Cây Lá khôi (Ardisia gigantifolia) thuộc chi Ardisia họ Đơn nem (Myrsinaceae) thu thập tại huyện Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên, được bảo quản tại phòng Thí nghiệm Y - Sinh - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại Khoa học - Đại học Thái Nguyên.
2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Môi trường nuôi cấy tế bào RPMI 1640 và DMEM-F12 (Invitrogen), huyết thanh bò (Invitrogen), Trypsin, Kháng sinh Ampicilin/Streptomycin (Invitrogen), DMSO, MTT và propidium iodide (PI) (Sigma) và các Primer do Quiagen cung cấp.
Trang thiết bị nghiên cứu: Kính hiển vi đảo ngược Nikon Eclipe 2 (Nhật Bản); Kính hiển huỳnh quang Olympus (Nhật Bản); Máy đo quang phổ SPECTROstar Nano – BMG Labtech (Đức); Tủ nuôi cấy tế bào ổn nhiệt CO2 (Thermo Fisher Scienetific) và các thiết bị phụ trợ khác.
2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Phòng Thí nghiệm Y - Sinh - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại Khoa học - Đại học Thái Nguyên.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 05/2018 đến tháng 07/2019.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp thu thập và xác định tên khoa học của cây Lá khôi
Sử dụng phương pháp thu thập mẫu cây Lá khôi theo Nguyễn Nghĩa Thìn (2007) [3].
Xác định tên khoa học theo phương pháp chuyên gia, kết hợp với cuốn “Thực vật chí Việt Nam” tập 4, họ Đơn nem (Myrsinaceae) của Trần Thị Kim Liên [9].
2.4.2. Phương pháp thu dịch chiết cây Lá khôi
300 gam mẫu lá của Lá khôi được thu nhận, rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 42°C trong 48h. Tiếp theo, mẫu lá được nghiền nhỏ bằng chày cối sứ thành bột mịn. 15 gam bột thu được sẽ được cho vào ống Falcon thể tích 50ml. Để chiết rút dịch chiết tổng số, 30ml Ethanol tuyệt đối được bổ sung vào ống Falcon chứa 15 gam bột lá và được lắc 200 rpm/ phút trong 48h. Dịch chiết thu được được lọc bằng giấy lọc Whatman, sau đó được làm khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 50°C trong 48h. Cặn thu được sau bay hơi sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.4.3. Phương pháp nuôi cấy tế bào 2D
Dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 được nuôi cấy trong điều kiện nuôi cấy bám dính (2D) trong môi trường DMEM/F12 Glutamax có bổ sung 10% huyết thanh bò (FBS) và 1% hỗn hợp kháng sinh Ampicillin/Streptomycin (P/S), trong điều kiện 37oC, 5% CO2. 100.000 tế bào ung thư dạ dày dòng MKN45 được nuôi cấy trong hộp nuôi cấy diện tích 75cm2, trong môi trường nuôi cấy RPMI 1640 (Invitrogen) bổ sung 10% huyết thanh bò và kháng sinh 1% Penicillin/Streptomycin.
Môi trường nuôi cấy được thay ngày một lần bằng một môi trường nuôi cấy mới. Sau 5 ngày nuôi cấy, các tế bào được xử lý với Trypsine 0,05% trong 3 phút. Tế bào được thu lại bằng ly tâm 1.300 rpm/phút trong 5 phút và được cấy chuyển sang một bình nuôi cấy mới. Tế bào sống, chết được đếm dưới kinh hiển vi đảo ngược Nikon Eclipe 2, sử dụng Trypan blue làm thuốc nhuộm cho tế bào chết.
2.4.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào 3D
Nuôi cấy các tế bào ung thư dạ dày MKN45 với mật độ 2.000 tế bào/giếng nuôi cấy có diện tích 3,8 cm2, bề mặt không bám dính (3D) để hình
thành nên tumorsphere (khối tế bào ung thư hình cầu). Sử dụng môi trường DMEMF12/Glutamax có bổ sung 1% Ampicillin/Streptomycin, yếu tố tăng trưởng biểu mô EGF 20 ng/ml, yếu tố tăng trưởng thượng bì FGF 20ng/ml, 0,3% Glucose, 5µg/ml Insulin ở 370C, 5% CO2.
2.4.5. Phương pháp phân tích chu kỳ tế bào bằng Flow cytometry
2x105 tế bào của dòng MKN45 được nuôi cấy trên đĩa loại 12 giếng. Sau 24 giờ, tế bào được xử lý bằng môi trường nuôi cấy chứa dịch chiết Lá khôi ở nồng độ 75 µg/ml. Các giếng đối chứng không bổ sung dịch chiết Lá khôi. Thời gian xử lý là 48 giờ trong điều kiện 370C, 5% CO2. Tiếp theo, các tế bào được tách khỏi bề mặt đĩa bằng cách xử lý với trysin/EDTA và được thu lại bằng ly tâm 1.500 rpm/phút trong 3 phút và được cố định trong ethanol 75% ở -20°C qua đêm. Tiếp theo, tế bào được nhuộm với dung dịch Fluorochrome (0,1% Sodium citrate (wt/v); 0,1% Triton X-100 (v/v), 50 mg l-1 PI trong nước khử ion vô trùng) trong thời gian 2 giờ ở 40C trước khi phân tích bằng hệ thống Flow cytometry BD-Accuri C6 plus (BD-Bioscinces). Kết quả dữ liệu được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng cho hệ thống BD-Accuri C6 plus.
2.4.6. Phương pháp phân tích miễn dịch huỳnh quang
Các tumorsphere sau 5 ngày nuôi cấy được thu nhận bằng ly tâm 1.300 rpm trong 3 phút và rửa 2 lần với đệm PBS 1X. Nhuộm tế bào lần lượt với kháng thể 1 là kháng thể đơn dòng chuột kháng protein P21 của người được cung cấp bởi Santa Cruz, tỷ lệ 1:500 ở 37ºC trong 45 phút và kháng thể 2 kháng IgG của chuột gắn chất phát quang Alexa Fluor 488 do Thermo Scientific cung cấp, nồng độ 1:2.000 ở 37ºC trong 20 phút. Rửa tế bào 2 lần với PBS 1X bằng phương pháp li tâm, ở lần rửa thứ 2 tế bào được rửa trong đệm PBS chứa chất nhuộm nhân tế bào DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindole do Sigma cung cấp) nồng độ 10µg/ml. Các tế bào sau khi được ủ với kháng thể sẽ được đặt trên lamen và được quan sát, chụp ảnh dưới kính hiển vi huỳnh quang NIKON ở độ phóng đại 200 lần với phần mềm chuyên dụng.
2.4.7. Phương pháp tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA
RNA tổng số của tế bào MKN45 được tách chiết bằng Trizol theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Invitrogen). Tế bào nuôi cấy trên đĩa 6 giếng được bổ sung 1.000 µl Trizol, dùng pipette 1ml mix nhiều lần để tách tế bào ra khỏi bề mặt đĩa. Ủ tế bào ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút ở 4ºC. Chuyển dịch nổi sang ống eppendorf mới. Bổ sung 2ml Choloroform, vontex mẫu trong 15 giây và ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút. Ly tâm 10.000 rpm/phút trong 15 phút ở 4ºC, lặp lại 2 lần. Làm khô RNA trong 5 – 10 phút và bổ sung 100 µl nước khử ion. Đo quang phổ tại các bước sóng 260/280 nm bằng máy đo quang phổ NanoDrop. Sử dụng 1µg RNA để tạo cDNA bằng Quantitect Reverse Transcriptase (RT) kit (do Quiagen cung cấp) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.4.8. Phương pháp phân tích biểu hiện gen bằng Realtime PCR
Phân tích Realtime PCR sử dụng 20ng cDNA cho mỗi phản ứng PCR với tổng thể tích là 20 µl với chất phát huỳnh quang SYBR Green qPCR do Invitrogen cung cấp. Danh sách các gen nghiên cứu với mã số cặp mồi tương ứng do Quiagen cung cấp và được trình bày trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Mã số cặp mồi của các gen
Tên gen Mã số cặp mồi Nguồn cung cấp
CD44 QT00073549 Qiagen ALDH QT00013286 Qiagen SOX2 QT00237601 Qiagen CCNE1 QT00041986 Qiagen CCND1 QT00495285 Qiagen P21 QT00006615 Qiagen P27 QT00244993 Qiagen PCNA QT00024633 Qiagen
Ghi chú: Toàn bộ các mồi được Qiagen cung cấp ở dạng
Sự thay đổi về mức độ biểu hiện gen được tính theo phương pháp Delta delta ct (ΔΔCt). Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình của 3 lần lặp lại của thí nghiệm với độ lệch chuẩn SD, cỡ mẫu cho mỗi lần thí nghiệm n=3.
2.4.9. Phương pháp phân tích thống kê
Phân tích giá trị khác biệt về mặt thống kê giữa các nhóm đối chứng và nhóm thí nghiệm theo Mann - Whitney, sử dụng phần mềm GraphPad Prism 5.0.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả thu thập và xác định tên khoa học và thu dịch chiết ethanol cây Lá khôi cây Lá khôi
Cây Lá khôi được thu thập tại huyện Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên, sau đó được xử lý tươi ngoài thực địa và xử lý khô tại phòng thí nghiệm. Mẫu cây Lá khôi được xác định tên khoa học là loài Ardisia gigantifolia Stapf. và lưu trữ tại phòng thí nghiệm Sinh học – khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.
Hình 3.1. Mẫu cây Lá khôi (Ardisia gigantifolia Stapf.)
Từ 15 gam bột Lá khôi, sau khi tách chiết bằng ethnol đã thu được 1,81 gam cao khô tương ứng với tỷ lệ 12,1%. Toàn bộ cao khô được hòa tan trong DMSO và sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Nuôi cấy tăng sinh tế bào trong điều kiện nuôi cấy 2D
Nuôi cấy tế bào (2D) đã được sử dụng như mô hình in vitro để nghiên cứu phản ứng của tế bào đối với các kích thích từ các tín hiệu sinh lý và sinh hóa [38]. Để chuẩn bị vật liệu cho các nghiên cứu tiếp theo thì việc nuôi cấy tăng sinh tế bào trong điều kiện 2D có vai trò rất quan trọng. Trong nghiên cứu này, dòng tế bào MKN45 đã được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS và kháng sinh. Kết quả nuôi cấy được trình bày trong hình 3.2
Hình 3.2. Nuôi cấy tăng sinh tế bào MKN45 trong điều kiện nuôi cấy 2D
(Thang đo 50 µm)
Kết quả hình 3.2 cho thấy, sau 5 ngày nuôi cấy, các tế bào MKN45 sinh trưởng tốt trên bề mặt hộp nuôi cấy. Các tế bào có hình dạng ovan hoặc hình
tròn điển hình. Các tế bào sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy 2D được thu nhận tế bào phục vụ cho nuôi cấy 3D và các nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên chu kỳ tế bào.
3.3. Nuôi cấy tumorsphere của các tế bào ung thư dạ dày trong điều kiện nuôi cấy 3D nuôi cấy 3D
Để thử tác động của dịch chiết Lá khôi lên sự hình thành và phát triển của các tumorsphere, chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào từ các tế bào nuôi cấy 2D. Kết quả nuôi cấy hình 3.3 cho thấy, trên bề mặt không bám dính và môi trường chứa các chất sinh trưởng FGF, EGF, insulin, các tế bào gốc ung thư đã tạo ra các khối cầu hay còn gọi là tumorsphere. Các tumosphere được hình thành và tăng dần kích thước theo thời gian nuôi cấy. Từ kích thước nhỏ gồm 5-7 tế bào trong ngày thứ 2 nuôi cấy, các tumosphere đã tăng kích thước nhanh chóng sau 4–7 ngày nuôi cấy. Ở ngày nuôi cấy từ 5–7 ngày, các tumorsphere đã có kích thước hình cầu điển hình chứa một lượng lớn tế bào đơn so với ngày nuôi cấy thứ 2 hoặc 3.
Hình 3.3. Nuôi cấy tumorpshere hình thành từ các tế bào gốc ung thư dạ
dày MKN45 theo thời gian nuôi cấy từ 0 đến 7 ngày. Thang đo 50 µm. Ảnh chụp ở độ phóng đại 200 lần.
Các tumosphere sau 7 ngày nuôi cấy có đường kính từ 100 - 300µm. Đây là tiền đề quan trọng để chúng tôi tiến hành thí nghiệm tiếp theo là xử lý các tumorsphere với dịch chiết Lá khôi trước khi tiến hành phân tích ảnh hưởng của dịch chiết lên chu kỳ tế bào và sự biểu hiện của các gen quan tâm.
3.4. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên số lượng và kích thước các tumorsphere tumorsphere
Để khẳng định được ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên sự phát triển của các tumorsphere. Xử lý các tumorsphere sau 5 ngày nuôi cấy với dịch
chiết Lá khôi ở nồng độ 75µg/ml, thời gian xử lý 48h. Đây là nồng độ tương ứng với giá trị IC50 của dịch chiết Lá khôi đã được chỉ ra trong một nghiên