CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Giới thiệu chung về cây Lá khôi
1.3.1. Phân loại và đặc điểm
Họ Đơn nem (Myrsinaceae) là một họ thực vật khá lớn, bao gồm 50 chi và khoảng 1.400 loài, được phân bố rộng rãi trên thế giới, nhất là ở các nước có khí hậu ơn đới và nhiệt đới. Trong đó, chi Cơm nguội (Ardisia) có khoảng 400-500 loài [18]. Trên thế giới chi Ardisia là một chi lớn thuộc họ
Myrsinaceae, có khoảng 500 loài, phân bố phần lớn ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, châu Á, số ít ở châu Úc và các đảo ở Thái Bình Dương. Ở Việt Nam chi
Ardisia có khoảng 101 lồi. Dạng sống chủ yếu của các loài thuộc chi này là
cây gỗ nhỏ, cây bụi hoặc nửa bụi gần với dạng cây thân thảo [9].
Cây Lá khôi thuộc chi Ardisia hay cịn gọi là Lài sơn, cây Lá khơi có tên khoa học là Ardisia gigantifolia Stapf. [2]. Trong cuốn “Thực vật chí Việt
Nam” của Trần Thị Kim Liên, tập 4 (trang 173) có mơ tả như sau: Cây Lá khôi là cây bụi lớn hoặc nửa bụi, cao khoảng 1-2(3) m, có thân rễ bị dày, phần thân đứng thẳng có đường kính khoảng 1cm, thường khơng phân cành, khơng có lơng, trừ thân rất non có lơng mềm thưa. Lá thường tập trung ở đầu thân, phiến mỏng hình bầu dục hoặc hình mác dạng trứng, 24-48(60) x 7-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 17(19) cm, chóp lá tù có mũi nhọn, gốc hình nêm và men xuống thành cánh ở cuống lá, mép khía răng cưa nhỏ nhọn dày đặc, hai mặt khơng có lơng hoặc có lơng mềm nhỏ thưa trên gân ở mặt dưới, có điểm tuyến lồi thưa thớt, nhiều hơn ở gần mép lá, gân bên khoảng 15-20 đơi, hướng lên, cuống dài 2-4cm. Cụm hoa hình chùm tán ở nách lá, dài 18-30(35) cm, có lơng mềm nhỏ, mỗi tán có 9-15 hoa; cuống hoa dài 1-1,5 cm; lá bắc và lá bắc con hình giải, có lơng nhỏ và điểm tuyến. Hoa màu hồng hoặc trắng. Lá đài hơi hợp ở gốc, hình tam giác hoặc mác, đầu nhọn dài 1,5-2 mm, có điểm tuyến và có lơng quanh mép. Cánh hoa hình trứng dài 4-5 mm, có điểm tuyến. Nhị dài bằng 2/3 cánh hoa, bao phấn hình trứng. Bầu hình cầu, nhẵn hoặc có lơng rất nhỏ, vịi nhụy dài gần bằng cánh hoa, nỗn nhiều, 1 vịng. Quả hình cầu đường kính khoảng 6 mm, màu hồng có gân tuyến và điểm tuyến [9].
Theo tác giả Võ Văn Chi [2] và Trần Thị Kim Liên [9], nhiều loài Ardisia ở Việt Nam được dân gian sử dụng làm thuốc được phân bố ở Sơn La, Bắc Giang, Hà Nội (Ba Vì), Hà Nam, Ninh Bình, Nghệ An, Quảng Trị, Thừa Thiên - Huế, Kon Tum. Cây ra hoa tháng 3-6, có quả tháng 11-12. Mọc ở rừng thưa, rừng rậm, sườn đồi, thung lung, khe núi, bờ suối nơi ẩm có bóng râm.
1.3.2. Thành phần hóa học của cây Lá khơi
Lồi Ardisia gigantifolia có phần thân, rễ đã được sử dụng từ lâu để điều
trị 35 các bệnh thấp khớp, đau cơ, đau xương hay đau do chấn thương. Bốn tritecpenoid saponin kiểu oleane được phân lập từ thân rễ loài này được thử hoạt tính gây độc tế bào, kết quả cho thấy 3 trong 4 hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc tế bào lên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm là NCI-H460, SF-268, MCF-7 và HepG2 [83]. Một hợp chất có khung coumarin được phân lập từ phần thân rễ cũng cho thấy hoạt tính gây độc tế bào mạnh lên các dịng tế bào ung thư PC-3 và A549 [75]. Một dẫn xuất resorcinol được phân lập từ phần thân rễ chỉ ra hoạt tính gây độc tế bào mạnh lên các dịng tế bào PC-3, EMT6, A549, HeLa, RM-1 và SGC7901 [61].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Bằng các phản ứng hóa học đặc trưng đã xác định được nhóm chất chính trong lá cây Lá khơi là tannin pyrogallic. Hàm lượng polyphenol tổng số trong cao chiết nước và cao chiết cồn 80% từ lá cây Lá khôi lần lượt là 5,03±0,05% và 8,09±0,11%, trong khi hàm lượng tannin tổng số tương ứng là 0,85±0,04% và 0,52±0,01%. Cao chiết nước và chiết cồn 80% từ lá cây Lá khôi gây độc yếu trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm SK-LU-1, MCF-7, Hela, AGS, và SK- Mel-2. Cao chiết nước Lá khôi thể hiện tác dụng dọn gốc tự do SOD và ức chế xanthin oxidase trung bình yếu trong khi cao chiết cồn lá cây Lá khôi không thể hiện tác dụng này ở liều thử nghiệm trên in vitro [12].
Theo tác giả Nguyễn Hoàng Anh và cộng sự cũng đã nghiên cứu về thành phần hóa học của hai lồi Ardisia silvestris và Ardisia gigantifolia vào năm 1996, trong đó cơng bố đã tìm thấy hai dẫn xuất resocinol là 2-methyl-5- (Z-nonadec-14-enyl)resorcinol và 5-(Z-nonadec14-enyl)resorcinol. Ngoài ra, từ lá của loài A. silvestris, một số sterol như 38 stigmasterol, spinasterol là
hàm lượng chính, cịn có 24-methylenecholesterol, stigmast-22-en-3β-ol, 22- dihydrospinasterol cùng một số các hợp chất tritecpen khác lanost-8-en-3β-ol, taraxerol, lano-sterol, β-amyrin, 24-methylenelanost-8-en3β-ol và 24- methylenecycloartanol đã được tìm thấy [39].
Bốn hợp chất triterpenoid saponin mới (1-4) đã được phân lập từ thân rễ của Ardisia gigantifolia. Các cấu trúc của chúng được làm sáng tỏ bằng
phương pháp nghiên cứu quang phổ C-NMR, bao gồm kỹ thuật 2D-NMR. Các hoạt động gây độc tế bào của saponin 1-4 được báo cáo đối với ba dòng tế bào ung thư ở người, gồm tế bào ung thư cổ tử cung Hela, các tế bào ung thư bàng quang EJ và tế bào ung thư dạ dày BCG-823 ở người [57].
Một saponin triterpenoid mới, có tên 3-O-β-d-glucopyranosyl- (1 → 3) -β-d-xylopyranosyl- (1 → 2) - [α-l-rhamnopyranosyl- (1 → 3)] -- d- glucopyranosyl- (1 → 4) - [β-d-glucopyranosyl- (1 → 2)] - α-l- arabinopyranosyl-3β, 16α, 28,30-tetrahydroxy-olean-12-ene (1) với bốn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn triterpenoids đã biết (2-5), được phân lập từ thân rễ của Ardisia gigantifolia.
Cấu trúc của chúng đã được làm sáng tỏ bằng phương pháp quang phổ. Các hợp chất 1-4 cho thấy hoạt động gây độc tế bào chống lại các dòng tế bào Hela, EJ, BCG và HepG-2. Tỷ lệ tế bào apoptotic sớm sau khi điều trị bằng một saponin triterpenoid đã tăng đáng kể so với các tế bào đối chứng (p <0,05) [54].
Mười bảy 13,28-epoxy triterpenoid saponin thu được từ Ardisia gigantifolia đã được đánh giá các hoạt động chống tăng sinh của chúng trên các tế bào MCF-7. Phân tích mối quan hệ cấu trúc - hoạt động chỉ ra rằng nhóm CH3 tại C-30, bốn đơn vị sacaride có L-rhamnose tại R6 trong các đơn vị đường rất quan trọng đối với hoạt động gây độc tế bào trên MCF-7. Các hợp chất 1, 2, 6, 7, 12 và 14 đã được chọn để xác định hoạt động chống tăng sinh trên ba dòng tế bào ung thư vú khác (T47D, MDA-MB-231 và SK-BR-3) [52].
Trong quá trình phân lập định hướng hoạt tính kháng lao của dịch chiết CHCl3 từ phần lá và thân của loài Ardisia gigantifolia, đã phân lập được hai dẫn xuất alkylresorcinol là 5- (8Z-heptadecenyl) resorcinol (1) và 5- (8Z- pentadecenyl) resorcinol (2) cùng với đó là 15 dẫn xuất khác đã được tổng hợp từ các hợp chất tự nhiên. Những hợp chất này (gồm cả tách chiết từ thiên nhiên và tổng hợp) sau đó được đánh giá hoạt tính chống lao thực hiện trên vi khuẩn lao Mycobacterium H37 RV, một loại vi khuẩn gây ra bệnh lao ở
người. Kết quả hai dẫn xuất resorcinol (1) và (2) thể hiện hoạt tính chống lao với các giá trị MIC lần lượt là 34,4; 79,2 μM trong phương pháp MABA và 91,7; 168,3 μM trong phương pháp Lora [14].
1.3.3. Các nghiên cứu về tác dụng của cây Lá khôi trong điều trị ung thư
Theo nghiên cứu của Mu L và cộng sự năm 2014 thì chiết xuất etanolic của rễ lồi Ardisia gigantifolia (AGB-5) (Trung Quốc), có thể ảnh hưởng đến sự tăng sinh của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú ở người (MCF-7) trong ống nghiệm và khám phá tế bào ung thư dưới tác dụng của AGB-5 trên chuột
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn được ghép với các tế bào MCF-7. Trong một mơ hình in vivo, AGB-5 đã giảm thể tích khối u, mang lại tế bào hồng cầu và tế bào bạch cầu gần bằng giá trị bình thường, tăng cường superoxide disutase và catalase của chuột mang MCF-7. Đây là nghiên cứu đầu tiên xác minh hoạt động chống ung thư của A.
gigantifolia in vivo. Kết quả cho thấy, AGB-5 có thể có tác dụng có lợi đối
với ung thư biểu mơ tuyến vú ở người [53].
AG36 là sản phẩm biến đổi sinh học của triterpenoid saponin từ Ardisia gigantifolia. Năm 2017, tác giả Li-Hua Mu và cộng sự đã chỉ ra hoạt động chống
ung thư và các cơ chế phân tử cơ bản của AG36 chống lại các tế bào ung thư vú MCF-7, MDA-MB và SK-BR-3 ở người. Các nghiên cứu in vivo cho thấy AG36 ức chế đáng kể sự phát triển của khối u MCF-7 ở chuột so với đối chứng. Cụ thể, AG36 ức chế sự tăng sinh tế bào MCF-7, MDA-MB-SK và SK-BR-3. Vì vậy, AG36 có thể là một tác nhân điều trị ung thư vú tiềm năng [51].
Hợp chất 1, một saponin triterpenoid từ Ardisia gigantifolia cho thấy
hoạt động chống khối u tiềm năng, gồm có 3 dẫn xuất (2-4). Trong số đó, hợp chất 2 và 3 là hợp chất mới. Các hợp chất 3 được đánh giá về khả năng gây độc tế bào đối với ung thư biểu mơ tế bào gan và tế bào gan bình thường. Hợp chất 3 cho thấy độc tính tế bào tốt hơn đối với các dịng tế bào Bel-7402 và HepG2 và độc tính tế bào yếu hơn nhiều so với tế bào L02 gan bình thường so với kiểm sốt dương tính [58].
Ba triterpenoid saponin mới, 1- 3, cùng với hai saponin được biết đến, 4 và 5, đã được phân lập từ thân rễ của Ardisia gigantifolia. Kết cấu của chúng được làm sáng tỏ bằng các nghiên cứu quang phổ NMR 1D và 2D. Saponin 1, 2, 4, và 5 có tính độc tế bào đáng kể đối với bốn dòng tế bào ung thư của người, như tế bào ung thư cổ tử cung Hela, tế bào u ác tính EJ, tế bào gan hepatoma và các tế bào ung thư dạ dày BCG ở người [56].
Hợp chất 1, một saponin triterpenoid từ Ardisia gigantifolia cho thấy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn deglycosyl (2 và 3) bởi Alternaria Alternata AS 3.6872. Cả hai dẫn xuất này là các hợp chất mới. Cấu trúc của chúng đã được làm rõ trên cơ sở dữ liệu quang phổ xoay 1D, 2D NMR, HR-ESI-MS và quang học. Các hợp chất 1-3 được đánh giá về khả năng gây độc tế bào chống lại ung thư tế bào gan và tế bào gan bình thường [59].
Mười ba 13,28-epoxy triterpenoid saponin đã được phân lập từ cây Lá khôi và một saponin có tiềm năng chống khối u đã được methyl hóa bởi H2SO4 để tạo ra bốn hợp chất mới. Phân tích mối quan hệ cấu trúc và hoạt động chỉ ra rằng sự kết hợp của nhóm O tại C-16, L-rhamnose tại R (5) và nhóm acetyl ở OH-6 của D-glucose dẫn đến tăng đáng kể hoạt tính gây độc trên A549 và HCT-8 nhưng làm giảm đáng kể hoạt tính gây độc tế bào trên các tế bào Bel-7402 [55].
Mức độ ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên apoptosis 3 dòng tế bào (AGS, MKN45, MKN74) khác nhau, cụ thể như sau: Tỷ lệ apoptosis ở dòng AGS là 11,5 ± 5,2% cao nhất trong 3 dòng, tiếp theo là dòng MKN45 với tỷ lệ 6,5 ± 0,5%; thấp nhất ở dòng MKN74 với tỷ lệ 3,3 ± 1,1%. Như vậy, mặc dù ở nồng độ 100 µg là một nồng độ có khả năng ức chế 70 – 80% khả năng sinh trưởng của tế bào nhưng khả năng cảm ứng apoptosis đối với cả 3 dòng tế bào chỉ đạt từ 3,3 – 11,5%; đây là một tỷ lệ rất thấp so với một số nghiên cứu khác. Kết quả này chỉ ra rằng dịch chiết Lá khơi là ít độc cho các tế bào và khả năng ức chế cao sự phân chia nhưng ít gây ra apoptosis, đó có thể là do một cơ chế sinh học khác như sự biệt hóa tế bào gốc, sự già hóa [7].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu
Dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45, do Phịng thí nghiệm Inserm U1053 - Viện Sức khỏe và Nghiên cứu Y học Quốc gia - Cộng hòa Pháp cung cấp, được lưu trữ tại phịng Thí nghiệm Y - Sinh - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại Khoa học - Đại học Thái Nguyên.
Cây Lá khôi (Ardisia gigantifolia) thuộc chi Ardisia họ Đơn nem
(Myrsinaceae) thu thập tại huyện Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên, được bảo quản tại phịng Thí nghiệm Y - Sinh - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại Khoa học - Đại học Thái Nguyên.
2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Mơi trường nuôi cấy tế bào RPMI 1640 và DMEM-F12 (Invitrogen), huyết thanh bò (Invitrogen), Trypsin, Kháng sinh Ampicilin/Streptomycin (Invitrogen), DMSO, MTT và propidium iodide (PI) (Sigma) và các Primer do Quiagen cung cấp.
Trang thiết bị nghiên cứu: Kính hiển vi đảo ngược Nikon Eclipe 2 (Nhật Bản); Kính hiển huỳnh quang Olympus (Nhật Bản); Máy đo quang phổ SPECTROstar Nano – BMG Labtech (Đức); Tủ nuôi cấy tế bào ổn nhiệt CO2 (Thermo Fisher Scienetific) và các thiết bị phụ trợ khác.
2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Phịng Thí nghiệm Y - Sinh - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại Khoa học - Đại học Thái Nguyên.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 05/2018 đến tháng 07/2019.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp thu thập và xác định tên khoa học của cây Lá khôi
Sử dụng phương pháp thu thập mẫu cây Lá khôi theo Nguyễn Nghĩa Thìn (2007) [3].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Xác định tên khoa học theo phương pháp chuyên gia, kết hợp với cuốn “Thực vật chí Việt Nam” tập 4, họ Đơn nem (Myrsinaceae) của Trần Thị Kim Liên [9].
2.4.2. Phương pháp thu dịch chiết cây Lá khôi
300 gam mẫu lá của Lá khôi được thu nhận, rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 42°C trong 48h. Tiếp theo, mẫu lá được nghiền nhỏ bằng chày cối sứ thành bột mịn. 15 gam bột thu được sẽ được cho vào ống Falcon thể tích 50ml. Để chiết rút dịch chiết tổng số, 30ml Ethanol tuyệt đối được bổ sung vào ống Falcon chứa 15 gam bột lá và được lắc 200 rpm/ phút trong 48h. Dịch chiết thu được được lọc bằng giấy lọc Whatman, sau đó được làm khơ trong tủ sấy ở nhiệt độ 50°C trong 48h. Cặn thu được sau bay hơi sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.4.3. Phương pháp ni cấy tế bào 2D
Dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 được ni cấy trong điều kiện ni cấy bám dính (2D) trong mơi trường DMEM/F12 Glutamax có bổ sung 10% huyết thanh bò (FBS) và 1% hỗn hợp kháng sinh Ampicillin/Streptomycin (P/S), trong điều kiện 37oC, 5% CO2. 100.000 tế bào ung thư dạ dày dòng MKN45 được ni cấy trong hộp ni cấy diện tích 75cm2, trong môi trường nuôi cấy RPMI 1640 (Invitrogen) bổ sung 10% huyết thanh bò và kháng sinh 1% Penicillin/Streptomycin.
Môi trường nuôi cấy được thay ngày một lần bằng một môi trường nuôi cấy mới. Sau 5 ngày nuôi cấy, các tế bào được xử lý với Trypsine 0,05% trong 3 phút. Tế bào được thu lại bằng ly tâm 1.300 rpm/phút trong 5 phút và được cấy chuyển sang một bình ni cấy mới. Tế bào sống, chết được đếm dưới kinh hiển vi đảo ngược Nikon Eclipe 2, sử dụng Trypan blue làm thuốc nhuộm cho tế bào chết.
2.4.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào 3D