Chƣơng 1 TỔNG QUAN
1.4. Các phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi
1.4.3. Phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
1.4.3.1.Vi khuẩn A. tumefaciens
Trong tự nhiên, vùng cổ rễ của những loài thực vật hai lá mầm thƣờng xuất hiện những khối u gồm các tế bào không phân hóa và phát triển khơng có tổ chức.
Những tế bào này phân chia một cách liên tục khơng thể kiểm sốt nhƣ tế bào ung thƣ ác tính ở động vật. Hiện nay, loại khối u này đã đƣợc biết đến là mụn cây do loài vi khuẩn A. tumefaciens gây nên. A. tumefaciens là vi khuẩn Gram âm, có khả năng chèn các gen của mình vào tế bào vật chủ và sau đó sử dụng bộ máy của vật chủ để biểu hiện các gen này dƣới dạng hợp chất dinh dƣỡng cho chúng. Vi khuẩn
A. tumefaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, tạo
nên những mụn sần trên cây [70, 80]. Cơ chế hình thành khối u cảm ứng này đã đƣợc nghiên cứu từ nhiều năm nay và đã mang lại nhiều thành tựu quan trọng trong ứng dụng vi khuẩn A. tumefaciens vào chuyển gen ở thực vật và nấm [31, 37].
Đến nay bản chất phân tử của quá trình cảm ứng phát sinh khối u do vi khuẩn A. tumefaciens gây ra đã đƣợc làm sáng tỏ. Các tế bào bị thƣơng tiết ra
những hợp chất polyphenolic thu hút các tế bào vi khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên, vi khuẩn A. tumefaciens không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển một
đoạn DNA nhỏ (T-DNA: tranferred DNA) vào bên trong tế bào. Đoạn DNA này nằm trên một plasmid đặc biệt gọi là Ti plasmid (tumor inducing plasmid) [70]. T- DNA sau khi chèn vào hệ gen của tế bào vật chủ sẽ gây ra khối u ở thực vật. Sự phát triển của khối u sau đó sẽ khơng cịn phụ thuộc vào sự có mặt của vi khuẩn
Agrobacterium [37, 81]. 1.4.3.2. Ti plasmid
Trong những năm 1970, các nhà khoa học đã tìm thấy trong những chủng vi khuẩn A. tumefaciens tạo khối u có một plasmid rất lớn kích thƣớc từ 200 - 800 kb [22, 81]. Từ những thí nghiệm trên những chủng A. tumefaciens khơng có plasmid
này, ngƣời ta kết luận plasmid nói trên cần thiết cho tạo khối u. Vì vậy, chúng đƣợc gọi là Ti plasmid (Tumor inducing plasmid). Cấu trúc của một Ti plasmid đƣợc thể hiện trên Hình 1.4.
Hình 1.4. Cấu trúc của Ti plasmid [81]
Trên Ti plasmid chứa 2 yếu tố cần thiết cho quá trình chuyển gen: vùng gen
vir - virulence genes (vùng độc lực) và T-DNA. Vùng gen vir chứa khoảng 25 gen
mã hóa cho các protein (virA, virG, virE và một số protein khác) có vai trị cắt, chuyển và chèn vùng T-DNA vào hệ gen của tế bào chủ. Sự hoạt động của vùng gen vir này đƣợc cảm ứng bởi một hợp chất phenolic có nguồn gốc từ thực vật có tên là acetosyringone (AS) [70]. Một vài Ti plasmid chỉ có một T-DNA, một số khác lại có thể có nhiều vùng T-DNA. T-DNA là một đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 10 - 30 kb, chiếm tỷ lệ nhỏ hơn 10% kích thƣớc của Ti plasmid, đƣợc chuyển vào trong hệ gen của tế bào chủ. T - DNA đƣợc giới hạn bởi 2 vùng: biên trái (LB) và biên phải (RB) chứa trình tự lặp lại 25 bp có độ tƣơng đồng cao và là vị trí nhận biết cho việc cắt T-DNA. T-DNA mang các gen liên quan đến việc tạo khối u [69]. Những gen này sau khi đƣợc gắn vào hệ gen của tế bào chủ sẽ tham gia vào quá trình tổng hợp auxin và cytokinin. Đây là các hợp chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục dẫn đến hình thành khối u. Nhờ đặc điểm này, ngƣời ta có thể loại bỏ các gen tạo khối u nằm trong hai đầu biên của T-DNA và thay vào đó bằng các gen mong muốn. Khi các gen tạo khối u bị loại bỏ, tế bào chủ hoặc mô thực vật chuyển gen có thể phát triển bình thƣờng. Nếu khơng có trình tự tƣơng đồng giữa
hệ gen của tế bào chủ và T-DNA đƣợc chuyển, T-DNA sẽ đƣợc chèn một cách ngẫu nhiên vào hệ gen của tế bào chủ. Nếu những đoạn gen có độ tƣơng đồng cao với hệ gen của tế bào chủ, sự tái tổ hợp tƣơng đồng sẽ xảy ra. Tần suất tái tổ hợp tƣơng đồng khác nhau khi chuyển những đoạn gen có kích thƣớc khác nhau [31]. Ngồi các gen tạo khối u, trên T-DNA còn chứa một nhóm gen opine. Những gen này mã hóa cho các enzyme giúp cho tế bào thực vật tổng hợp một số axit amin đặc biệt mà vi khuẩn A. tumefaciens có khả năng phân giải, đƣợc gọi là opine. Đây là một nhóm các hợp chất hóa học đƣợc sử dụng nhƣ nguồn cũng cấp nitơ chính cho A. tumefaciens [107].
1.4.3.3.Cơ chế lây nhiễm của vi khuẩn A. tumefaciens
Vi khuẩn A. tumefaciens chủ yếu lây nhiễm thực vật qua các vết thƣơng. Thực vật bị thƣơng tiết ra các hợp chất trong đó có đƣờng và các axit vơ cơ sẽ thu hút vi khuẩn xâm nhiễm theo cơ chế hóa hƣớng động. Khi tiếp cận đƣợc vết thƣơng, chúng tấn công vào bề mặt và tổng hợp nên các sợi cellulose, đồng thời thực vất tiết ra hợp chất phenolic (acetosyringone) hoạt hóa vùng gen vir của vi khuẩn. Hệ thống điều hịa gen vir hoạt động thơng qua 2 gen độc virA, virG. VirA tổng hợp nên protein VirA nằm trong màng tế bào, đáp ứng với sự trao đổi chất ở vết thƣơng và nhạy cảm với sự thay đổi của mơi trƣờng. Với nồng độ AS thích hợp, sự có mặt của đƣờng sẽ kích thích gen virA dẫn đến sự tự phosphoryl hóa của VirA. Sự tự
phosphoryl hóa này dẫn đến hệ quả protein nội bào VirG đƣợc phosphoryl hóa bởi axit aspartic cịn lại từ sự phosphoryl hóa của VirA và kích hoạt tất cả sự sao mã của các gen vir. Sau khi đƣợc kích hoạt, các gen vir sẽ điều khiển sự tạo thành sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn. Quá trình này đƣợc thực hiện bởi protein VirD1 và VirD2. Sau đó, VirD2 sẽ gắn vào T-DNA tạo thành phức hợp sợi đơn T-DNA. Phức hợp T-DNA-VirD2 và VirE sẽ đƣợc chuyển vào tế bào thực vật nhờ hệ thống chuyển nạp đƣợc mã hóa bởi các gen virB. Operon virB gồm 11 gen mã hóa cho việc hình thành cầu nối pili, là con đƣờng vận chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào trong tế bào thực vật. Các protein của vi khuẩn sẽ đƣa T-DNA vào trong nhân tế bào nhờ
sự hỗ trợ của một số thành phần trong tế bào thực vật. Ở trong nhân, T-DNA sẽ chèn một cách ngẫu nhiên vào hệ gen của vật chủ [70, 80, 22].
1.4.3.4. Phương pháp chuyển gen thơng qua vi khuẩn A. tumefaciens
Khi có mặt chất cảm ứng, vi khuẩn A. tumefaciens sẽ chuyển T-DNA của nó vào tế bào thực vật. Lợi dụng cơ chế này, A. tumefaciens đƣợc dùng làm sinh vật trung gian để chuyển gen vào thực vật từ những năm 1980. Năm 1998, vi khuẩn này lần đầu tiên đƣợc ứng dụng thành công để chuyển gen vào nấm sợi. Phƣơng pháp này đƣợc đánh giá là phƣơng pháp đơn giản để chuyển gen vào nấm sợi và đã đƣợc thực hiện thành công trên nhiều loại nấm sợi khác nhau [22, 69, 70, 96].
Chuyển gen thông qua A. tumefaciens cần một hệ thống vector nhị thể. Hệ
vector nhị thể đặc trƣng bởi hai plasmid tái bản độc lập gồm vector nhị thể (binary vector) chứa T-DNA mang gen cần chuyển và Ti plasmid cải biến chỉ mang vùng gen vir hỗ trợ cho việc chuyển T – DNA (còn gọi là helper plasmid). Vector nhị thể đƣợc thiết kế bao gồm các thành phần: điểm khởi đầu sao chép hoạt động ở cả E.
coli và A. tumefaciens, MCS (multiple cloning site - vị trí cắt nối đa điểm), các
marker chọn lọc hoạt động đƣợc ở vi khuẩn và vật chủ, biên trái và biên phải của T- DNA. Ti plasmid hỗ trợ (helper plasmid) đƣợc cải biến từ Ti plasmid bình thƣờng bằng cách loại bỏ các gen tạo khối u và giữ lại vùng gen vir để duy trì chuyển DNA vào tế bào chủ [40]. Hệ thống vector nhị thể đƣợc Michielse và các cộng sự mơ tả trong Hình 1.5.
Hình 1.5. Mơ hình vi khuẩn A. tumefaciens với hệ thống vector nhị thể [69]
Một hệ thống vector khác cũng từng đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp ATMT là vector đồng tích hợp (co - integrated vector). Vector đồng tích hợp hoạt động dựa trên cơ chế tái tổ hợp tƣơng đồng giữa plasmid nhỏ có nguồn gốc từ vi khuẩn và Ti plasmid. Ti plasmid cũng đƣợc loại bỏ vùng gen tạo khối u và giữ nguyên vùng gen vir hỗ trợ quá trình chuyển gen vào tế bào chủ. Plasmid nhỏ của vi khuẩn đƣợc thiết kế gắn gen cần chuyển vào giữa vùng biên trái (LB) và biên phải (RB). Khi cả hai vector có mặt trong cùng một vi khuẩn A. tumefaciens, quá trình tái tổ hợp diễn ra khiến cho gen cần chuyển đƣợc tích hợp vào vùng T-DNA của plasmid [72]. Ngày nay, hệ thống vector đồng tích hợp trở nên ít phổ biến hơn so với hệ thống vector nhị thể do khó khăn trong q trình thiết kế [57]. Hơn nữa, sử dụng vector nhị thể có nhiều thuận lợi hơn vector đồng tích hợp do khơng cần q trình tái tổ hợp in vivo. Tốc độ chuyển gen khi sử dụng vector nhị thể nhanh hơn,
chỉ mất 2 - 3 ngày trong khi chuyển gen sử dụng vector đồng tích hợp phải mất 4 - 7 ngày. Hơn nữa, hiệu quả chuyển gen khi sử dụng hệ thống vector nhị thể đƣợc chứng minh hiệu quả hơn rất nhiều so với khi sử dụng vector đồng tích hợp [72].
1.4.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (ATMT) là
phƣơng pháp đơn giản đƣợc sử dụng phổ biến hiện nay nhờ những ƣu điểm vƣợt trội. Tuy nhiên, hiệu suất chuyển gen vào nấm phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố khác nhau.
Yếu tố đầu tiên ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen nhờ A. tumefaciens là
nguyên liệu dùng chuyển gen. Nguyên liệu ban đầu dùng cho chuyển gen thành cơng vào nấm rất đa dạng, có thể là bào tử, tế bào trần, hệ sợi, … [37, 69]. So với hai phƣơng pháp chuyển gen bằng tế bào trần và chuyển gen bằng xung điện yêu cầu nguyên liệu đầu vào bắt buộc là tế bào trần thì đây là một ƣu điểm nổi bật do quá trình tạo tế bào trần khá phức tạp, địi hỏi kỹ thuật cao và chi phí đắt đỏ. Thời gian bảo quản bào tử nấm cũng có thể ảnh hƣởng tới hiệu quả của chuyển gen. Nguyên liệu đƣợc bảo quản trong thời gian dài sẽ làm giảm hiệu quả chuyển gen trong q trình đồng ni cấy với vi khuẩn, hoặc giảm tỷ lệ nảy mầm của các bào tử chuyển gen so với bào tử mới [69].
Sự thành công của phƣơng pháp ATMT cũng đƣợc quyết định bởi chủng vi khuẩn A. tumefaciens. Các chủng vi khuẩn A. tumefaciens đã đƣợc sử dụng thành công để chuyển gen vào nấm sợi cũng rất đa dạng nhƣ AGL1, LBA4404, EHA105, LBA1100, ... Hiệu suất chuyển gen khi dùng các chủng vi khuẩn A. tumefaciens là khác nhau với các vật chủ khác nhau nên. Chủng LBA1100 và plasmid pTiB6 đƣợc kết luận là cho hiệu quả chuyển gen cao vào A. awamori và A. niger. Những chủng vi khuẩn A. tumefaciens khác cũng đƣợc sử dụng ở A. awamori nhƣ A348, LBA1119, LBA1126 … nhƣng phải sử dụng Ti plasmid hỗ trợ khác mới cho hiệu quả. Phƣơng pháp ATMT sử dụng chủng vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 ở nấm A.
oryzae cũng đƣợc chứng minh là rất hiệu quả. Với mỗi chủng vi khuẩn A. tumefaciens cần phải điểu chỉnh các yếu tố của việc đồng nuôi cấy để thu đƣợc kết
quả tốt nhất [69, 77, 78].
Nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS) cũng là một yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Trong hầu hết
các nghiên cứu trƣớc đây, AS đƣợc bổ sung trong môi trƣờng cảm ứng ở giai đoạn đồng nuôi cấy nhằm cảm ứng hoạt động của gen vir [31, 69, 80]. Ở một số trƣờng hợp, AS còn đƣợc bổ sung trong giai đoạn nuôi lắc cảm ứng với A. tumefaciens
nhƣng khơng bắt buộc, thậm chí cịn có thể làm giảm hiệu suất biến nạp với các vật chủ nhƣ Fusarium oxysporum, Magnaporthe grisea [69, 70].
Một yếu tố quyết định tới hiệu quả chuyển gen bằng phƣơng pháp ATMT là tỷ lệ đồng nuôi cấy giữa nguyên liệu nấm và vi khuẩn A. tumefaciens. Tăng tế bào vi khuẩn A. tumefaciens và nấm có thể làm tăng hiệu quả chuyển gen. Tuy nhiên, cả hai yếu tố trên có một giới hạn nhất định. Nếu tăng lƣợng tế bào vi khuẩn A. tumefaciens vƣợt quá nồng độ thích hợp sẽ dẫn đến hiện tƣợng cạnh tranh dinh
dƣỡng, và gây khó khăn trong việc tiêu diệt vi khuẩn khi chuyển sang môi trƣờng chọn lọc thể nấm chuyển gen. Ngƣợc lại, quá nhiều bào tử nấm sẽ dẫn đến tình trạng mọc nền hoặc việc phân lập thể chuyển gen sẽ rất khó khăn [69, 70].
Điều kiện đồng nuôi cấy vi khuẩn và nguyên liệu nấm cũng là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến hiệu quả của phƣơng pháp ATMT. Điều kiện đồng nuôi cấy nấm và vi khuẩn gồm thời gian, nhiệt độ và loại màng lọc. Nhiệt độ đồng nuôi cấy dao động từ 20°C - 28°C, nhƣng nhiệt độ tối ƣu thƣờng là từ 22°C - 25°C, trong thời gian từ 2 - 3 ngày [22, 80]. Ở nấm A. awamori, nhiệt độ thích hợp cho chuyển gen là 20oC - 28 oC và thời gian đồng nuôi cấy kéo dài từ 16 - 96 giờ. Tuy nhiên, điều kiện tối ƣu là 22.5oC - 25oC trong thời gian 2 - 3 ngày [69]. Ngoài ra, các loại màng lọc khác nhau nhƣ cellulose, nitrocellulose, nylon cũng sẽ cho hiệu suất chuyển gen khác nhau [69].
Ngồi những yếu tố cơ bản trên, cịn có một số yếu tố khác cũng ảnh hƣởng tới hiệu quả của việc chuyển gen nhƣ loài nấm, nồng độ kháng sinh, quy trình chuyển gen... Vì vậy, muốn hiệu quả chuyển gen cao nhất cần tối ƣu các điều kiện để tìm ra quy trình phù hợp nhất với từng lồi.
Chuyển gen vào nấm sợi bằng phƣơng pháp ATMT đƣợc đánh giá là tốt hơn so với các phƣơng pháp chuyển gen truyền thống nhƣ chuyển gen bằng xung điện, chuyển gen bằng tế bào trần. Thứ nhất, nguyên liệu đƣợc dùng để đồng nuôi cấy với
A. tumefaciens vô cùng đa dạng. Chúng có thể là bào tử, tế bào trần, sợi nấm, bào tử
nảy mầm, hoặc thậm chí là từ cặn tế bào [69, 70]. Trong khi đó, phƣơng pháp chuyển gen bằng tế bào trần đòi hỏi nguyên liệu nấm phải là các tế bào trần hình thành từ khuẩn ty sau khi xử lý với phức hệ enzyme. Mặc dù hiệu suất chuyển gen vào nấm bằng tế bào trần cũng rất cao nhƣng trên thực tế tiến hành gặp nhiều cản trở. Nguồn nguyên liệu tế bào trần đƣợc tạo ra sau khi sử dụng hỗn hợp enzyme loại bỏ thành tế bào nấm phải đƣợc sử dụng ngay, nên các thí nghiệm cần hồn thiện trong ngày. Việc sử dụng các loại enzyme đắt tiền để loại bỏ thành tế bào nấm cũng là một khó khăn với hầu hết các phịng thí nghiệm tại Việt Nam. Chất lƣợng của tế bào trần phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ tuổi của hệ sợi nấm, loại enzyme dùng để loại bỏ thành tế bào, thời gian ủ giữa sợi nấm và enzyme, … Quy trình chuyển gen qua protoplast với nhiều bƣớc phức tạp đòi hỏi ngƣời thực hiện phải có kỹ năng cao. Chính vì vậy, hiệu suất chuyển gen thƣờng không ổn định giữa những lần thực hiện khác nhau [59, 65].
Thứ hai, hiệu suất chuyển gen bằng phƣơng pháp ATMT thƣờng cao và ổn định hơn so với các phƣơng pháp truyền thống. Theo thống kê, hiệu quả chuyển gen bằng ATMT thƣờng đạt đƣợc 300 - 900 thể chuyển gen với 107 bào tử, cao hơn 600 lần so với phƣơng pháp chuyển gen bằng tế bào trần nhờ polyethylene glycol (PEG) [90]. Chuyển gen vào A. awamori nhờ A. tumefaciens có hiệu suất cao hơn
phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp bằng PEG khoảng 400 lần [69]. Với vật chủ là
Colletotrichum gloeosporioides, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacteium cao gấp 5
- 10 lần so với chuyển gen nhờ tế bào trần. Với một số vật chủ khác, chẳng hạn nhƣ
Neurospora crassa, Trichoderma reesei, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacterium
tƣơng tự với hiệu suất chuyển gen nhờ tế bào trần đã đƣợc tối ƣu [12, 21, 70].