Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4.2.Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợi A.oryzae
3.4. Biểu hiện gen DsRed ở A.oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil sử dụng vector
3.4.2.Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợi A.oryzae
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục sử dụng vector pEX2A với marker
pyrG của A. niger dùng để chuyển vào hai chủng A. oryzae VS1, RIB40 trợ dƣỡng
uridine/uracil nhằm đánh giá khả năng chuyển và biểu hiện gen huỳnh quang đỏ
Quy trình chuyển gen vào nấm sợi A. oryzae trợ dƣỡng uridine /uracil đƣợc tiến hành theo quy trình của Nguyễn Thị Khuyến và cộng sự đã đƣợc công bố trƣớc đây [77]. Vi khuẩn A. tumefaciens đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng cảm ứng (IM), bổ sung hợp chất phenolic acetosyringone (AS) với nồng độ 200 mM để kích thích q trình chuyển T-DNA. Ngồi ra, mơi trƣờng cảm ứng IM cần bổ sung 0,05% uridine và 0,05% uracil để hỗ trợ bào tử A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil nảy
mầm và quá trình chuyển gen xảy ra. Bào tử tƣơi (nồng độ106 bào tử/ml) của hai chủng VS1 và RIB40 đƣợc sử dụng và thời gian đồng nuôi cấy là 60 giờ (2,5 ngày) ở 22ºC để thu đƣợc các thể chuyển gen trên mơi trƣờng chọn lọc.
Hình 3.15. Quy trình chuyển gen vào A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil
Sau 3 - 4 ngày ở nhiệt độ 28oC - 30oC, trên đĩa chuyển gen xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ. Trong khi đó, đĩa đối chứng (-) sử dụng vi khuẩn A. tumefciens không mang vector pEX2A, trên đĩa chuyển gen không xuất hiện khuẩn lạc nào. Kết quả chuyển gen của 2 chủng A. oryzae VS1 và RIB40 đƣợc thể hiện trên Hình 3.17.
Hình 3.16. Kết quả chuyển gen DsRed vào A. oryzae chủng RIB40 và VS1 trợ
dƣỡng uridine/uracil
Các thể chuyển gen DsRed đƣợc chọn lọc trên mơi trƣờng M + Met có bổ sung kháng sinh cefotaxime (300 µg/ml) để diệt vi khuẩn A. tumefaciens. Chuyển
gen vào chủng A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil sử dụng bào tử nồng độ 106
bào tử/ml thu đƣợc 4 - 8 thể chuyển gen/đĩa. Chủng A.oryzae RiB40 trợ dƣỡng với nồng độ bào tử tƣơng ứng thu đƣợc từ 71 – 112 thể chuyển gen/đĩa.
Để xác nhận các thể chuyển gen thu đƣợc trên đĩa đã nhận đƣợc gen cần chuyển, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên và tách chiết DNA của một số khuẩn lạc, sau đó PCR kiểm tra với 2 cặp mồi An-pyrG-P1/P2 và DsRed-F/R. Ở chủng A. oryzae RIB40∆pyrG, tất cả các thể chuyển gen cho băng 2,8 kb với cặp mồi An-pyrG- P1/P2 (Hình 3.17A), và cho băng 730 bp với cặp mồi DsRed-F/R đúng với kích thƣớc marker pyrG của A. niger và gen chỉ thị huỳnh quang đỏ DsRed (Hình 3.17B). Quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang, hệ sợi của tất cả các thể chuyển gen đều cho tín hiệu huỳnh quang đỏ mạnh (Hình 3.17C). Nhƣ vậy, gen huỳnh quang đỏ DsRed với marker trợ dƣỡng pyrG của A. niger đã đƣợc biểu hiện thành
Hình 3.17. Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed ở chủng A. oryzae RIB40 trợ dƣỡng
uridine/uracil. (A) PCR xác nhận với cặp mồi An-pyrG-P1/P2, (B) PCR xác nhận với cặp mồi DsRed-F/R, (C) Cấu trúc hệ sợi nấm dƣới kính hiển vi huỳnh quang Ở chủng VS1, đĩa chuyển gen thậm chí xuất hiện một số khuẩn lạc có màu hồng (Hình 3.16). Kết quả thu đƣợc khi PCR sử dụng cặp mồi DsRed-F/R là các chủng VS1 chuyển gen xuất hiện băng 730 bp, phù hợp với kích thƣớc gen DsRed,
đối chứng âm sử dụng DNA tổng số của chủng trợ dƣỡng khơng cho băng nào (Hình 3.18A). Ngồi ra, khi tiến hành quan sát hệ sợi của các thể chuyển gen VS1 dƣới kính hiển vi huỳnh quang, 100% các thể chuyển gen đƣợc chọn ngẫu nhiên quan sát cho tín hiệu huỳnh quang đỏ mạnh (Hình 3.18B).
Hình 3.18. Xác nhận chuyển gen DsRed vào A. oryzae VS1∆pyrG sử dụng vector
pEX2A. (A,B) PCR xác nhận gen DsRed 3 thể chuyển gen (V1,V2,V3) sử dụng cặp mồi AnpyrG-P1/P2 và DsRed-F/R, (B) Hệ sợi các thể chuyển gen dƣới kính hiển vi
Nhƣ vậy, gen huỳnh quang đỏ DsRed đã đƣợc biểu hiện thành công ở chủng nấm sợi A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil bằng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens với marker trợ dƣỡng pyrG của A. niger.
Gen huỳnh quang đỏ DsRed đƣợc điều khiển bởi promoter gpdA từ nấm sợi
A. nidulans lần đầu tiên đƣợc biểu hiện thành công ở A. oryzae bằng phƣơng pháp
chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens với marker trợ dƣỡng pyrG của A. niger.
Biểu hiện của gen DsRed dƣới sự kiểm soát của promoter gpdA cịn dẫn đến kiểu hình đỏ trên đĩa mơi trƣờng tƣơng tự nhƣ ở một số nấm sợi khác nhƣ Acremonium
chrysogenum và Penicillium paxilli [44, 71]. Điều này cho thấy biểu hiện của gen dƣới sự điều khiển của promoter gpdA từ A. nidulans có hiệu quả trên các lồi nấm khác nhau thuộc chi Aspergillus. Promoter gpdA trong vector nhị thể tạo có thể
đƣợc thay thế bằng các promoter mạnh khác nhƣ amyB, melO, glaA, tefl để nâng
cao hiệu quả biểu hiện gen trên loài nấm sợi an toàn này [77, 78].
Nấm sợi A. oryzae đã đƣợc nghiên cứu chuyển gen từ nhiều năm nay, tuy
nhiên phƣơng pháp duy nhất là chuyển gen thông qua tế bào trần [32, 66]. Phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens, sử dụng marker kháng kháng sinh đã đƣợc áp dụng thành công với rất nhiều loại nấm sợi, nhƣng không khả thi với A. oryzae do khả năng kháng tự nhiên với nhiều loại kháng sinh. Do đó, gen trợ dƣỡng pyrG là một giải pháp tối ƣu làm marker chuyển vào A. oryzae. Mới đây, phƣơng
pháp chuyển gen vào nấm sợi A. oryzae trợ dƣỡng với marker pyrG của chính A. oryzae đã đƣợc thực hiện thành công [77]. Tuy nhiên, đây là lần đầu tiên gen pyrG
của A. niger đƣợc sử dụng làm marker để chuyển vào A. oryzae trợ dƣỡng theo
phƣơng pháp ATMT với hiệu quả chuyển gen lên tới 400 - 800 thể chuyển gen/106
bào tử với chủng VS1 và 710 - 1120 thể chuyển gen/106
bào tử với chủng quốc tế RIB40. Hơn nữa, hiệu suất biểu hiện gen huỳnh quang đỏ ở nghiên cứu này đạt 100% với cả hai chủng VS1 và RIB40. Nhƣ vậy, việc sử dụng gen pyrG của A. niger làm marker chuyển gen vào A. oryzae là hoàn tồn khả thi. Điều này góp phần
chứng minh gen pyrG của một số lồi trong chi Aspergillus có khả năng biểu hiện ở các lồi nấm sợi có quan hệ gần gũi, mở ra triển vọng cho nghiên cứu chuyển gen
trợ dƣỡng vào các lồi nấm sợi phục vụ cho lợi ích nghiên cứu và kinh tế của con ngƣời.