Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2.7.Sàng lọc các thể chuyển gen
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.7.Sàng lọc các thể chuyển gen
Sau khi thu đƣợc các thể chuyển gen riêng rẽ trên đĩa môi trƣờng chọn lọc, các chủng này đƣợc thuần khiết bằng phƣơng pháp cấy ria ba pha. Sau khi nuôi cấy và tách chiết DNA, các thể chuyển gen sẽ đƣợc xác nhận bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Xác nhận các thể xóa gen pyrG
Đối với các thể đột biến xóa gen pyrG, các khuẩn lạc nấm xuất hiện trên môi trƣờng chọn lọc có 5-FOA sẽ đƣợc cấy chuyển đồng thời lên môi trƣờng CD + 0,1% uracil + 0,1% uridine, CD + 0,1% uracil + 0,1% uridine + 0,2% 5-FOA và môi trƣờng CD không bổ sung uridine và uracil để kiểm tra khả năng sinh trƣởng. Các chủng xóa gen pyrG khơng sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng CD không bổ
sung uridine, uracilvà sinh trƣởng đƣợc trên mơi trƣờng có 5-FOA. Ngƣợc lại, chủng tự nhiên sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng không bổ sung uridine, uracil, nhƣng bị ức chế trên mơi trƣờng có 5-FOA. Các chủng kháng 5-FOA đƣợc nuôi cấy và tách chiết DNA tổng số sau đó đƣợc PCR xác nhận với 3 cặp mồi đặc hiệu An- pyrG-P1/P2, An-pyrG-ORF-F/R và An-pyrG-ORF-F/An-pyrG-P3 (Bảng 2.2).Các thể chuyển gen đƣợc xác nhận xóa gen thành cơng khi kích thƣớc của sản phẩm PCR nhỏ hơn 564 bp so với kích thƣớc của đoạn pyrG nguyên gốc đƣợc PCR từ
DNA tổng số của chủng nấm A. niger N402.
Xác nhận các thể chuyển gen sử dụng vector pEX2A
Các thể chuyển gen sử dụng vector pEX2A đƣợc nuôi cấy, thu hệ sợi và tách chiết DNA tổng số sau đó PCR xác nhận với hai cặp mồi là An-pyrG-P1/P2và DsRed-F/R. Với cặp mồi An-pyrG-P1/P2, các thể chuyển gen thành công của chủng
A. niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil sẽ cho sản phẩm là 2 băng DNA kích thƣớc
2,78 và 2,2 kb tƣơng ứng với kích thƣớc gen pyrG nguyên gốc và gen pyrG của chủng trợ dƣỡng. Kết quả xác nhận chuyển gen của hai chủng A. oryzae VS1,
RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil cho 1 băng với kích thƣớc 2,78 kb tƣơng ứng với kích thƣớc gen pyrG của A. niger. Với cặp mồi DsRed-F/R, các cá thể chuyển gen
của cả 3 chủng N402, VS1, RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil sẽ cho sản phẩm với kích thƣớc 730 bp tƣơng đƣơng với kích thƣớc của gen mã hóa huỳnh quang đỏ
DsRed.
Xác nhận các thể chuyển gen sử dụng vector pEX2C
Đối với các thể chuyển gen sử dụng vector pEX2C, sau khi tách chiết DNA tổng số, DNA sẽ đƣợc sử dụng làm khuôn cho các phản ứng PCR xác nhận với 2 cặp mồi An-glaA-pro-F/R và DsRed-F/R. Kết quả thu đƣợc với cặp mồi An-glaA- pro-F/R là băng DNA với kích thƣớc 600 bp, tƣơng ứng với kích thƣớc promoter
glaA của A. niger. Kết quả PCR với cặp mồi DsRed-F/R cho băng DNA có kích thƣớc bằng với kích thƣớc gen DsRed-730 bp.
Xác nhận các thể chuyển gen huỳnh quang DsRed
Tất cả các thể chuyển gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed sẽ đƣợc tiến hành làm tiêu bản quan sát biểu hiện dƣới kính hiển vi huỳnh quang. Đặt một miếng giấy thấm vào đĩa petri, đặt hai chiếc tip 1000 µl lên trên miếng giấy, đặt lam kính lên trên hai chiếc tip và để lamen ở trên giấy thấm. Đĩa đƣợc khử trùng ở điều kiện 121°C, 1 atm, 15 phút. Sau khi khử trùng, thêm nƣớc cất vô trùng vào miếng giấy thấm để duy trì độ ẩm cho tiêu bản. Nhỏ một giọt môi trƣờng thạch PDA/CD lên trên lam kính. Đợi giọt thạch đơng, nhỏ 10 µl dịch bào tử nấm lên trên giọt thạch, đậy lamen lại. Tiêu bản đƣợc ủ ở 25°C trong 1,5 ngày, sau đó tiêu bản đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang.