Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Tạo thành công chủng N402 đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil
3.2.1. Tạo cấu trúc xóa gen pyrG
Để xóa gen pyrG ở nấm sợi A. niger, chúng tôi đã tạo một vector nhị thể với vùng T-DNA mang chỉ gen pyrG khơng cịn ngun vẹn. Cấu trúc xóa gen pyrG
đƣợc dựa trên cấu trúc của vector pKO2 cung cấp bởi Phịng Genomic - Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. Phƣơng pháp tạo vector xóa gồm ba bƣớc cơ bản. Bƣớc thứ nhất là khuếch đại đoạn pyrG nguyên gốc kích thƣớc 2,8 kb của nấm A. niger N402 (Hình 3.3B) bằng cặp mồi An-pyrG-P1/P2 (Bảng 2.2). Bƣớc thứ hai là
gắn đoạn pyrG vào khung vector pKO2 đã đƣợc xử lý bởi enzyme giới hạn. Bƣớc cuối cùng là cắt bỏ một đoạn 564 bp trên khung đọc mở bằng 2 enzyme giới hạn
BamHI và EcoRV, làm bằng đầu và đóng vịng plasmid nhằm làm hỏng vùng mã
hóa của gen pyrG để tạo thành vector xóa pKO2-pyrG (Hình 3.3A). Cấu trúc xóa gen pyrG sau đó đƣợc xác nhận bằng cắt kiểm tra với enzyme giới hạn XhoI (có
trình tự nhận biết ở hai đầu gen pyrG). Kết quả điện di trên gel agarose 0,7% cho
thấy kích thƣớc sản phẩm thu đƣợc từ vector xóa là 1,79 kb nhỏ hơn 564 bp so với kích thƣớc đoạn 2,35 kb cắt từ vector mang gen pyrG nguyên gốc (Hình 3.3C). Quy trình tạo vector xóa gen pyrG và sơ đồ cắt kiểm tra đƣợc thể hiện trên Hình 3.3.
Hình 3.3. Tạo cấu trúc xóa gen pyrG ở nấm Aspergillus niger. (A) Sơ đồ các bƣớc
tạo cấu trúc xóa gen pyrG, (B) Sản phẩm PCR đoạn pyrG của A. niger dùng tạo cấu trúc xóa gen, (C) Điện di sản phẩm cắt kiểm tra cấu trúc xóa pKO2-ΔpyrG với
enzym XhoI
Từ các kết quả trên, chúng tôi kết luận rằng vector pKO2-pyrG dùng để xóa gen pyrG ở A. niger đã đƣợc tạo thành công.