Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2.2.Xóa thành cơng gen pyrG ở A.niger N402
3.2. Tạo thành công chủng N402 đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil
3.2.2.Xóa thành cơng gen pyrG ở A.niger N402
Để xóa gen pyrG ở A. niger N402, đầu tiên vector xóa pKO2-ΔpyrG đƣợc
biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens bằng phƣơng pháp xung điện. Thêm 500 µl LB lỏng vào ống biến nạp và nuôi lắc ở 28oC, tốc độ 200 vịng/phút trong một giờ.
Dịch ni đƣợc ly tâm thu cặn và cấy trải trên đĩa LB có bổ sung kanamycin để chọn lọc các khuẩn lạc vi khuẩn nhận đƣợc cấu trúc xóa gen. Ba khuẩn lạc đƣợc chọn ngẫu nhiên để kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu An-pyrG-P1/P2 (Bảng 2.2 ). Kết quả cho thấy 2 khuẩn lạc cho sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 2,2 kb, nhỏ hơn 564 bp so với kích thƣớc của đoạn pyrG nguyên gốc là 2,8 kb (Hình 3.4). Nhƣ vậy, 2 trong 3 khuẩn lạc A. tumefaciens AGL1 đã nhận đƣợc cấu trúc xóa gen.
Hình 3.4. Kết quả PCR kiểm tra 3 khuẩn lạc AGL1 biến nạp vector xóa pyrG A1,
A2, A3. M: 1kb DNA marker, (+) Đối chứng dƣơng sử dụng khuôn là đoạn pyrG nguyên gốc 2,8 kb
Vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc xóa gen pyrG đƣợc sử dụng để chuyển vào nấm sợi A. niger. Quy trình xóa gen đƣợc thực hiện dựa trên quy trình xóa gen pyrG ở Aspergillus oryzae [77]. Một số thông số đã đƣợc thay đổi cho phù hợp với A. niger. Bào tử nấm và vi khuẩn A. tumefaciens đƣợc ủ chung trên môi
trƣờng cảm ứng ở nhiệt độ tối ƣu 22oC. Q trình đồng ni cấy kéo dài 2,5 ngày. Sau đó màng chuyển gen sẽ đƣợc chuyển sang đĩa mơi trƣờng chọn lọc CD có bổ sung 5-FOA, 0,1% uridine và 0,1% uracil để sàng lọc các thể xóa gen. Các bƣớc của quy trình xóa gen ở A. niger đƣợc tóm tắt trong Hình 3.5.
Hình 3. 5. Quy trình xóa gen pyrG ở nấm sợi A. niger sử dụng phƣơng pháp ATMT
Sau 5 ngày, trên môi trƣờng chọn lọc CD pH 5,5 + 0,1% uridine + 0,1% uracil + 0,2% 5-FOA, một số khuẩn lạc kháng 5-FOA xuất hiện trong khi đĩa đối chứng sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens khơng mang vector xóa khơng xuất hiện
khuẩn lạc nào. Kết quả của q trình xóa gen đƣợc thể hiện trong Hình 3.6.
Hình 3.6. Kết quả xóa gen trên mơi trƣờng chọn lọc CD bổ sung 0,1% uridine,
0,1% uracil và 0,2% 5 – FOA. Đối chứng sử dụng chủng AGL1 khơng mang vector xóa pyrG
Các thể nấm kháng 5-FOA đƣợc cấy chuyển đồng thời sang ba môi trƣờng CD; CD + 0,1% uridine + 0,1% uracil và CD + 0,1% uridine + 0,1% uracil + 0,2% 5-FOA sử dụng chủng tự nhiên A. niger N402 (WT) làm đối chứng. Kết quả cho thấy trên môi trƣờng tối thiểu CD, chủng đột biến không sinh trƣởng đƣợc trong khi chủng tự nhiên phát triển bình thƣờng. Ngƣợc lại, trên mơi trƣờng CD + uridine + uracil + 5-FOA, chủng đột biến có khả năng sinh trƣởng bình thƣờng trong khi chủng tự nhiên không sinh trƣởng đƣợc do sự chuyển hóa của 5-FOA gây độc tế bào. Cả chủng tự nhiên và chủng đột biến đều sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng CD + uridine + uracil (Hình 3.7).
Hình 3.7. Kiểm tra khả năng sinh trƣởng của chủng đột biến trên các môi trƣờng
khác nhau, đối chứng sử dụng chủng A. niger N402
Để khẳng định chính xác các chủng kháng 5-FOA thu đƣợc có phải là các chủng đột biến xóa gen pyrG hay khơng, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số từ 4 chủng nêu trên và kiểm tra cấu trúc gen pyrG bằng PCR với cặp mồi đặc
hiệu An-pyrG-P1/P2 (Bảng 2.2). Theo tính tốn lý thuyết, kích thƣớc sản phẩm PCR thu đƣợc đối với chủng tự nhiên là 2,78 kb; trong khi đó kích thƣớc sản phẩm PCR từ các chủng xóa gen pyrG sẽ nhỏ hơn 564 bp và vào khoảng 2,2 kb. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy chủng X4 là chủng đột biến xóa gen pyrG. Các
chủng X1, X2, X3 mặc dù kháng 5-FOA và khuyết dƣỡng uridine/uracil nhƣng gen
pyrG vẫn còn nguyên vẹn giống với chủng tự nhiên (Hình 3.8B). Có thể chủng X1,
X2, X3 do trong quá trình chuyển gen, T-DNA đã chèn ngẫu nhiên và làm hỏng một gen nào đó liên quan đến q trình sinh tổng hợp uridine/uracil.
Hình 3.8. Xác nhận các chủng xóa gen pyrG. (A) Sơ đồ trao đổi chéo và vị trí các
cặp mồi dùng để xác nhận chủng xóa gen, (B) PCR xác nhận 4 chủng đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil X1, X2, X3, X4 sử dụng cặp mồi AnpyrG-P1/P2, (C) PCR xác nhận chủng X4 sử dụng cặp mồi AnpyrG-ORF-F/R, (D) PCR xác nhận chủng X4 sử dụng cặp mồi AnpyrG-ORF-F/AnpyrG-P3. Đối chứng âm sử dụng nƣớc cất
Để khẳng định chắc chắn, chủng X4 là chủng xóa gen pyrG, chúng tơi tiếp
tục kiểm tra chủng đột biến xóa gen X4 với cặp mồi An-pyrG-ORF-F/R và cặp mồi kết hợp An-pyrG-ORF-F và mồi An-pyrG-P3 (Bảng 2.2). Cặp mồi An-pyrG-ORF khuếch đại khung đọc mở (ORF) gen pyrG, với chủng tự nhiên sẽ cho băng 1,05 kb, trong khi đó chủng đột biến lên băng 0,49 kb (Hình 3.8C). Nhƣ vậy, khung đọc mở của gen pyrG ở chủng đột biến X4 đã bị loại bỏ một đoạn kích thƣớc 564 bp giống nhƣ tính tốn lý thuyết. Cặp mồi An-pyrG-ORF-F/An-pyrG-P3 đƣợc sử dụng thêm để khẳng định rằng đoạn gen bị xóa nằm trên locus của gen pyrG, trong đó mồi An- pyrG-P3 gắn vào vùng nằm ngồi cấu trúc xóa. Kết quả thu đƣợc, chủng đột biến lên băng 1,52 kb, nhỏ hơn 564 bp so với chủng tự nhiên 2,08 kb (Hình 3.8D). Với tất cả những kết quả trên, chúng tôi kết luận rằng chủng đột biến X4 đã bị xóa gen
pyrG theo cơ chế tái tổ hợp tƣơng đồng.
Trƣớc đây, việc tạo chủng A. niger đột biến xóa gen pyrG đã đƣợc thực hiện thành cơng bằng phƣơng pháp sử dụng tia UV gây đột biến ngẫu nhiên và xóa gen theo cơ chế trao đổi chéo tƣơng đồng sử dụng biện pháp chuyển gen bằng tế bào trần [38, 79]. Tuy nhiên, sử dụng tia UV gây ra nhiều loại đột biến nhƣ dịch khung, thay thế nucleotide, xóa nucleotide, tái tổ hợp và sắp xếp lại vật chất di truyền. Mặt khác, tia UV thƣờng tạo ra nhiều đột biến ở những vị trí khác nhau nên rất khó để kiểm sốt cấu trúc di truyền của thể đột biến xóa gen [58]. Xóa gen bằng tế bào trần cũng cho hiệu suất cao nhƣng rất tốn kém do hóa chất và enzyme đắt tiền, hơn nữa quy trình thực hiện gồm nhiều bƣớc phức tạp [99]. Việc xóa gen pyrG sử dụng
phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đơn giản hơn so với
hai phƣơng pháp trên, dễ dàng tạo đƣợc đột biến đích theo cơ chế tái tổ hợp tƣơng đồng. Hơn nữa, đây là lần đầu tiên việc xóa gen pyrG đƣợc thực hiện thành cơng trên chủng nấm mốc A. niger N402 bằng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi