Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.6. Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens
Biến nạp vector vào vi khuẩn A. tumefaciens
Vector đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens bằng phƣơng pháp xung điện. Khuẩn lạc tƣơi chủng AGL1 đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng LB lỏng qua
đêm, 200 vòng/phút ở 28°C. Thu tế bào vi khuẩn bằng ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C. Rửa tế bào vi khuẩn ba lần bằng 10 ml HEPES 100 mM lạnh và một lần bằng glycerol 10%. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C giữa mỗi lần rửa. Hòa cặn tế bào trong 1 ml glycerol 10%. Chia 50 µl dịch tế bào AGL1 khả biến vào các ống eppendorf, làm đông nhanh trong nitơ lỏng và bảo quản ở -80°C. Khi biến nạp; trộn 0,5 µl plasmid vào 50 µl dịch tế bào khả biến, chuyển hỗn hợp vào cuvet 2 mm. Quá trình biến nạp đƣợc thực hiện bằng máy chuyển gen xung điện Bio-Rad với các thông số 2,5 kV, 400Ω, 25 µF. Sau khi kích hoạt xung điện, bổ sung 500 µl mơi trƣờng LB lỏng vào cuvet, trộn nhẹ và chuyển hỗn hợp sang ống eppendorf. Ni lắc 200 vịng/phút ở 28°C trong 1 giờ. Ly tâm thu tế bào ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 20 giây, cấy trải lên mơi trƣờng LB có bổ sung kanamycin (100 mg/l). Ủ đĩa ở 28°C, 2 - 3 ngày để thu đƣợc các khuẩn lạc kháng kanamycin. Các khuẩn lạc đƣợc kiểm tra bằng colony PCR (PCR sử dụng khuẩn lạc làm DNA khuôn) với mồi đặc hiệu để xác nhận vi khuẩn AGL1 đã nhận đƣợc vector mong muốn.
Chuyển gen vào nấm bằng vi khuẩn A. tumefaciens
Cấy một khuẩn lạc tƣơi đã đƣợc xác nhận bằng PCR từ đĩa LB có bổ sung kanamycin vào 20 ml LB lỏng, nuôi lắc qua đêm ở 28°C với tốc độ 200 vịng/phút. Hút 1 ml dịch ni cho vào bình tam giác có chứa 9 ml mơi trƣờng cảm ứng IM có bổ sung 200 µM AS, bọc giấy bạc để tránh ánh sáng. Nuôi lắc ở 28°C, 200 vòng/phút trong 5 - 6 giờ, cho tới khi OD của dịch ni đạt 0,6 đến 0,8. Trộn 100 µl dịch ni đã cảm ứng với 100 µl bào tử nấm (nồng độ 106 bào tử/ml) rồi trải đều lên màng cellulose đã đƣợc đặt sẵn trên đĩa môi trƣờng IM có bổ sung 200 µM AS. Đồng nuôi cấy trong hộp tối trong 2,5 ngày ở 22°C. Sau đó chuyển màng cellulose sang đĩa mơi trƣờng chọn lọc CD có bổ sung kháng sinh cefotaxime (300 mg/l) tác dụng diệt vi khuẩn A. tumefaciens AGL1. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 3 - 5 ngày để nhận đƣợc khuẩn lạc chuyển gen.
Đối với thí nghiệm xóa gen pyrG, 100 µl dịch ni đã cảm ứng đƣợc trộn với 100 µl bào tử nấm (107
bào tử/ml) rồi trải đều lên màng cellulose đã đặt sẵn trên môi trƣờng IM bổ sung 200 µM AS. Đồng ni cấy trong hộp tối 2,5 ngày trong 20°C. Sau đó chuyển màng sang đĩa môi trƣờng chọn lọc Czapek-Dox (CD) bổ sung 0,1% uracil; 0,1% uridine; 0,2% 5-FOA và kháng sinh cefotaxime (300 mg/l).