Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3.Tối ƣu quy trình chuyển gen vào A.niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil
DsRed là gen chỉ thị huỳnh quang đƣợc sử dụng phổ biến trong chuyển gen ở
nấm, thực vật và đã đƣợc biểu hiện thành cơng ở nhiều lồi nấm sợi nhƣ A. oryzae,
A. nidulans, A. fumigatus… Chính vì vậy, DsRed đƣợc chọn làm gen chỉ thị cho tối
ƣu quy trình chuyển gen vào A. niger trợ dƣỡng sử dụng phƣơng pháp ATMT và vector nhị thể tạo mới là pEX2A.
3.3.1. Tạo vector nhị thể pEX2A
Vector pEX2A đƣợc tạo dựa trên cấu trúc của vector pEX2, chứa gen mã hóa huỳnh quang đỏ DsRed đƣợc điều khiển bởi promoter gpdA từ A. nidulans và
marker trợ dƣỡng pyrG của A. niger. Đoạn gen pyrG của A. niger đƣợc khuếch đại với cặp mồi An-pyrG-P1/P2 (Bảng 2.2), sau đó đƣợc xử lý với hai enzyme XbaI và
EcoRI. Sau khi tinh sạch, đoạn cắt sẽ đƣợc gắn vào khung vector pEX2 đã đƣợc xử
lý trƣớc đó bởi 2 enzyme giới hạn EcoRI và SpeI (Hình 3.9). Vector pEX2A sau khi tạo thành đƣợc cắt kiểm tra bằng enzyme XhoI (có 2 trình tự nhận biết nằm bên
trong gen pyrG của A. niger và 1 trình tự nhận biết nằm trên khung vector pEX2).
Điện di sản phẩm của phản ứng cắt trên gel agarose 0,7% trong 30 phút, 90 V, kết quả thu đƣợc ba băng có kích thƣớc là 1,24 kb; 2,35 kb và 8,29 kb (Hình 3.9). Kết quả này phù hợp với tính tốn lý thuyết, nên có thể khẳng định cấu trúc vector pEX2A đã đƣợc tạo thành công.
Hình 3.9. Sơ đồ tạo cấu trúc vector pEX2A. (A) Quá trình nối đoạn pyrG của vào
khung vector pEX2 để tạo vector pEX2A, (B) Sơ đồ cắt kiểm tra vector pEX2A với enzyme XhoI và ảnh điện di kết quả cắt kiểm tra
3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ uridine/uracil đến sự phục hồi sinh trƣởng của chủng xóa gen pyrG chủng xóa gen pyrG
Chủng N402 xóa gen pyrG khơng có khả năng tự tổng hợp uridine/uracil nên không thể sinh trƣởng trên môi trƣờng tối thiểu khơng có mặt uridine/uracil. Vì đặc điểm này nên trong giai đoạn đồng nuôi cấy bào tử nấm và vi khuẩn A. tumefaciens, môi trƣờng cảm ứng IM phải đƣợc bổ sung uridine/uracil. Để xác định nồng độ uridine/uracil thích hợp cần phải bổ sung, chúng tơi tiến hành kiểm tra mức độ phục hồi của chủng xóa gen pyrG trên mơi trƣờng ni cấy có bổ sung các nồng độ uridine/uracil khác nhau. Các chủng xóa gen sẽ đƣợc cấy trên 9 mơi trƣờng tối thiểu CD bổ sung lần lƣợt: 0,01% uridine; 0,02% uridine; 0,03% uridine; 0,01% uracil; 0,02% uracil; 0,03% uracil; 0,01% uridine + 0,01% uracil; 0,02% uridine + 0,02%
uracil; 0,03% uridine + 0,03% uracil. Sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30°C, mức độ phục hồi của chủng xóa gen pyrG đƣợc thể hiện trong Hình 3.10.
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của nồng độ uridine/uracil đến khả năng sinh trƣởng của
chủng đột biến xóa gen pyrG. (A) Hình thái của chủng xóa gên trên CD môi trƣờng bổ sung 3 nồng độ uridine: 0,01%; 0,02%, 0,03%, (B) Hình thái của chủng xóa gen trên môi trƣờng CD bổ sung ba nồng độ uracil: 0,01%; 0,02%; 0,03%, (C) Hình thái
của chủng xóa gen trên mơi trƣờng CD bổ sung cả uridine và uracil với nồng độ mỗi loại: 0,01%; 0,02%; 0,03%
Trên môi trƣờng CD bổ sung 0,01% uracil; 0,02% uracil và 0,03% uracil cả chủng tự nhiên và chủng xóa gen đều sinh trƣởng đƣợc và hình thành bào tử màu đen, nhƣng chủng xóa gen phát triển chậm hơn rất nhiều so với chủng tự nhiên (Hình 3.10B). Trên mơi trƣờng CD bổ sung uridine, khuẩn lạc của chủng xóa gen có kích thƣớc tƣơng đƣơng với chủng tự nhiên, tuy nhiên chủng xóa gen gần nhƣ không sinh bào tử (0,01% uridine) hoặc lƣợng bào tử đƣợc sinh ra rất ít (0,02% và
uracil, chủng xóa gen sinh trƣởng chậm hơn một chút so với chủng tự nhiên (Hình 3.10C). Khi bổ sung 0,02% uridine và 0,02% uracil, gần nhƣ khơng có sự khác biệt giữa kích thƣớc của chủng đột biến xóa gen và chủng tự nhiên. Nhƣng khi bổ sung 0,03% uracil và 0,03% uridine cả hai chủng tuy có kích thƣớc tƣơng đƣơng nhau nhƣng lại phát triển chậm hơn khi ở nồng độ 0,02% uracil và 0,02% uridine (Hình 3.10C). Sự ức chế sinh trƣởng khi nồng độ uracil quá cao cũng đã đƣợc Nguyễn Thị Khuyến và cộng sự báo cáo ở loài A. oryzae [78]. Nhƣ vậy, mơi trƣờng tối thiểu có bổ sung 0,02% uridine và 0,02% uracil là môi trƣờng tốt nhất để phục hồi kiểu hình và khả năng sinh trƣởng của chủng A. niger xóa gen pyrG.
3.3.3. Tối ƣu quy trình chuyển gen vào A. niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil
Chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens đã đƣợc chứng minh là phƣơng
pháp đơn giản, cho hiệu quả cao và áp dụng đƣợc với rất nhiều loài nấm sợi. Tuy nhiên, hiệu suất chuyển gen phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố bao gồm: thời gian cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS), nồng độ bào tử, nhiệt độ và thời gian đồng nuôi cấy, nồng độ uridine/uracil trong môi trƣờng cảm ứng... Với mỗi lồi, cần một quy trình tối ƣu để đạt đƣợc hiệu suất chuyển gen mong muốn. Trong nghiên cứu này, một số thông số chuẩn áp dụng cho chuyển gen theo phƣơng pháp ATMT vào nhiều loài nấm sợi đƣợc giữ nguyên nhƣ nồng độ AS là 200 µM, thời gian nuôi cảm ứng 6 giờ, nhiệt độ đồng nuôi cấy 22°C… [69, 77]. Dựa trên kết quả về khả năng sinh trƣởng của chủng A. niger xóa gen pyrG trên các mơi trƣờng có bổ sung nồng độ uridine, uracil khác nhau (Hình 3.10), chúng tơi lựa chọn bốn môi trƣờng cảm ứng để tiến hành tối ƣu quy trình chuyển gen là: IM + 0,02% uridine; IM + 0,02% uracil, IM + 0,01% uridine + 0,01% uracil và IM + 0,02% uridine + 0,02% uracil. Hai nồng độ bào tử nấm đƣợc sử dụng chuyển gen là 105 và 106 bào tử/ml. Chủng vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 mang vector pEX2A đƣợc sử dụng để tối ƣu quy trình chuyển gen vào A. niger. Cấy một khuẩn lạc tƣơi của chủng vi
khuẩn này vào môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kanamycin (100 mg/l), ni lắc qua đêm ở 28°C với tốc độ lắc 200 vòng/phút. Hút 1 ml dịch vi khuẩn cho vào 9 ml mơi trƣờng IM lỏng có bổ sung AS (200 µM), bọc giấy bạc vào bình vi khuẩn, ni lắc
ở 28°C, 200 vòng/phút trong 6 giờ sao cho OD đạt 0,6-0,8. Trộn 100 µl dịch vi khuẩn đã đƣợc cảm ứng với 100 µl dịch bào tử (nồng độ 105 và 106 bào tử/ml). Hỗn hợp này đƣợc trải đều trên màng cellulose đặt trên 4 loại môi trƣờng cảm ứng bổ sung 200 µM AS, đồng nuôi cấy trong hộp tối ở 22°C trong 2,5 ngày. Sau đó màng cellulose đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc CD bổ sung cefotaxime (300 mg/l). Sau khi ủ đĩa 4 ngày ở 30°C, trên đĩa môi trƣờng chọn lọc xuất hiện các khuẩn lạc nấm chuyển gen riêng rẽ, số lƣợng khuẩn lạc thu đƣợc trên 1 ml dịch bào tử đƣợc thể hiện trên Hình 3.11.
Hình 3.11. Kết quả tối ƣu quy trình chuyển gen vào chủng A. niger N402 trợ dƣỡng
uridine/uracil
Các kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 3.11 cho thấy điều kiện nồng độ 106 bào tử/ml, môi trƣờng cảm ứng IM bổ sung 0,02% uridine và 0,02% uracil cho kết quả cao nhất khi chuyển gen vào chủng A. niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil. Ở điều kiện này, số thể chuyển gen thu đƣợc là 2250 ± 200 thể chuyển gen/106 bào tử. Ở cùng điều kiện bổ sung nồng độ 0,02% uridine và 0,02% uracil nhƣng giảm nồng độ bào tử xuống còn 105
uridine/uracil còn lại, số lƣợng thể chuyển gen thu đƣợc thấp hơn rất nhiều. Đặc biệt ở nồng độ 0,02% uracil, kết quả chuyển gen thu đƣợc chỉ đạt 67 ± 15 thể chuyển gen/105 bào tử. Nhƣ vậy, môi trƣờng IM bổ sung 0,02% uridine và 0,02 % uracil cùng với nồng độ 106
bào tử/ml là điều kiện tốt nhất để chuyển gen vào nấm sợi A.
niger trợ dƣỡng uridine/uracil. Quy trình chuyển gen tối ƣu đƣợc tóm tắt trong Hình
3.12.
Hình 3.12. Chuyển gen vào A. niger N402 trợ dƣỡng nhờ vi khuẩn A. tumefaciens,
(A) Quy trình chuyển gen tối ƣu, (B) Minh họa các thể chuyển gen xuất hiện trên đĩa môi trƣờng tối thiểu, đối chứng sử dụng vi khuẩn không biến nạp vector
Phƣơng pháp chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens đã đƣợc áp dụng
gen/106 bào tử), Trichoderma reesei (10-20 thể chuyển gen/105 bào tử), A. oryzae
(1060 ± 143 thể chuyển gen/106 bào tử) [69, 77, 105]. Phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi A. niger với marker pyrG bằng tế bào trần đã đƣợc thực hiện thành công
với hiệu quả 400 khuẩn lạc/107 tế bào trần [38]. Tuy nhiên, phƣơng pháp chuyển gen bằng tế bào trần có nhiều hạn chế nhƣ chi phí cao, các bƣớc thực hiện phức tạp địi hỏi nhiều kinh nghiệm và hiệu suất khơng ổn định với mỗi lần thực hiện [59, 65]. Phƣơng pháp chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens có thể sử dụng trực tiếp bào tử nấm để chuyển gen, quy trình thực hiện đơn giản và cho hiệu quả chuyển gen cao, ổn định giữa các lần thực hiện khác nhau [39]. Quy trình chuyển gen tối ƣu vào chủng A. niger trợ dƣỡng uridine/uracil nhờ vi khuẩn A. tumefacines đƣợc thiết lập trong nghiên cứu này với hiệu quả cao, lên tới 2200 thể chuyển gen/106 bào tử, cao hơn rất nhiều so với phƣơng pháp sử dụng tế bào trần (400 khuẩn lạc/107 tế bào trần). Quy trình chuyển gen tối ƣu vào A. niger sử dụng marker trợ dƣỡng pyrG đã mở ra triển vọng mới cho nghiên cứu biểu hiện enzyme và protein tái tổ hợp ở loài nấm sợi tiềm năng này.
3.3.4. Đánh giá hiệu quả chuyển gen huỳnh quang DsRed vào A. niger N402
trợ dƣỡng
Để xác nhận các khuẩn lạc thu đƣợc trên đĩa chuyển gen có nhận đƣợc gen chuyển, chúng tôi chọn ngẫu nhiên một vài khuẩn lạc cấy chuyển sang mơi trƣờng CD, sau đó tiến hành ni hệ sợi, tách chiết DNA và PCR xác nhận với hai cặp mồi DsRed-F/R và An-pyrG-P1/P2. Với cặp mồi An-pyrG-P1/P2, các thể chuyển gen lên 2 băng với kích thƣớc lần lƣợt là 2,8 kb và 2,2 kb, đối chứng âm sử dụng DNA tổng số của A. niger đột biến trợ dƣỡng xóa gen pyrG lên băng 2,2 kb (Hình 3.13A). Cặp mồi DsRed-F/R cho kết quả với các chủng chuyển gen là băng DNA có kích thƣớc 730 bp tƣơng ứng với kích thƣớc của gen DsRed, đối chứng âm sử dụng
DNA của chủng A. niger N402 xóa gen pyrG không xuất hiện băng nào (Hình
3.13B). Bên cạnh việc xác nhận chuyển gen bằng PCR, chúng tơi cịn tiến hành quan sát hệ sợi của các chủng chuyển gen dƣới kính hiển vi huỳnh quang. Kết quả
huỳnh quang rất tốt (Hình 3.12C). Nhƣ vậy, quy trình chuyển gen tối ƣu vào nấm sợi A. niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil đã biểu hiện thành công gen huỳnh
quang DsRed.
Hình 3.13. Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed ở chủng A. niger N402 trợ dƣỡng
uridine/uracil. (A) Kiểm tra bằng PCR gen pyrG, (B) Kiểm tra bằng PCR gen
DsRed, (C) Sợi nấm và cấu trúc cuống sinh bào tử của các thể chuyển gen dƣới kính
hiển vi huỳnh quang
3.4. Chuyển gen vào nấm mốc tƣơng A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil sử dụng vector pEX2A
3.4.1. Mức độ tƣơng đồng của gen pyrG trong chi Aspergillus
Gen pyrG của các loài thuộc chi Aspergillus có mức độ tƣơng đồng rất cao
khi so sánh với nhau. Trình tự gen pyrG của nấm A. niger có độ tƣơng đồng về axit amin đến 91,7% khi so sánh với A. oryzae và A. flavus, 91% so với A. parasiticus
và 89,2% so với A. fumigatus. Tuy nhiên, mức độ tƣơng đồng của gen pyrG ở A. niger chỉ đạt 50% khi so với trình tự của URA3 (sinh tổng hợp uracil) của
Sacharomyces cerevisiae (Hình 3.14). Mức độ tƣơng đồng cao về trình tự gen pyrG
có thể là cơ sở để sử dụng gen pyrG của A. niger làm marker cho chuyển gen vào các loài Aspergillus gần gũi. Một số nghiên cứu trƣớc đây đã chỉ ra rằng gen pyrG của nấm sợi A. niger có thể đƣợc sử dụng làm marker để chuyển gen vào A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil, gen pyrG của A. niger đƣợc biểu hiện thành công trong
nấm sợi A. oryzae và enzyme do nó mã hóa có khả năng hoạt động trong A. oryzae [66].
Hình 3.14. Sự tƣơng đồng của pyrG giữa các loài Aspergillus khác nhau. (A) Mức
độ tƣơng đồng về trình tự axit amin của protein PyrG/URA3 giữa các lồi nấm, (B) Khoảng cách di truyền giữa các loài nấm qua cây phân loại với gen pyrG/URA3.
3.4.2. Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợi A. oryzae
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục sử dụng vector pEX2A với marker
pyrG của A. niger dùng để chuyển vào hai chủng A. oryzae VS1, RIB40 trợ dƣỡng
uridine/uracil nhằm đánh giá khả năng chuyển và biểu hiện gen huỳnh quang đỏ
Quy trình chuyển gen vào nấm sợi A. oryzae trợ dƣỡng uridine /uracil đƣợc tiến hành theo quy trình của Nguyễn Thị Khuyến và cộng sự đã đƣợc công bố trƣớc đây [77]. Vi khuẩn A. tumefaciens đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng cảm ứng (IM), bổ sung hợp chất phenolic acetosyringone (AS) với nồng độ 200 mM để kích thích q trình chuyển T-DNA. Ngồi ra, mơi trƣờng cảm ứng IM cần bổ sung 0,05% uridine và 0,05% uracil để hỗ trợ bào tử A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil nảy
mầm và quá trình chuyển gen xảy ra. Bào tử tƣơi (nồng độ106 bào tử/ml) của hai chủng VS1 và RIB40 đƣợc sử dụng và thời gian đồng nuôi cấy là 60 giờ (2,5 ngày) ở 22ºC để thu đƣợc các thể chuyển gen trên môi trƣờng chọn lọc.
Hình 3.15. Quy trình chuyển gen vào A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil
Sau 3 - 4 ngày ở nhiệt độ 28oC - 30oC, trên đĩa chuyển gen xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ. Trong khi đó, đĩa đối chứng (-) sử dụng vi khuẩn A. tumefciens không mang vector pEX2A, trên đĩa chuyển gen không xuất hiện khuẩn lạc nào. Kết quả chuyển gen của 2 chủng A. oryzae VS1 và RIB40 đƣợc thể hiện trên Hình 3.17.
Hình 3.16. Kết quả chuyển gen DsRed vào A. oryzae chủng RIB40 và VS1 trợ
dƣỡng uridine/uracil
Các thể chuyển gen DsRed đƣợc chọn lọc trên mơi trƣờng M + Met có bổ sung kháng sinh cefotaxime (300 µg/ml) để diệt vi khuẩn A. tumefaciens. Chuyển
gen vào chủng A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil sử dụng bào tử nồng độ 106
bào tử/ml thu đƣợc 4 - 8 thể chuyển gen/đĩa. Chủng A.oryzae RiB40 trợ dƣỡng với nồng độ bào tử tƣơng ứng thu đƣợc từ 71 – 112 thể chuyển gen/đĩa.
Để xác nhận các thể chuyển gen thu đƣợc trên đĩa đã nhận đƣợc gen cần chuyển, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên và tách chiết DNA của một số khuẩn lạc, sau đó PCR kiểm tra với 2 cặp mồi An-pyrG-P1/P2 và DsRed-F/R. Ở chủng A. oryzae RIB40∆pyrG, tất cả các thể chuyển gen cho băng 2,8 kb với cặp mồi An-pyrG- P1/P2 (Hình 3.17A), và cho băng 730 bp với cặp mồi DsRed-F/R đúng với kích thƣớc marker pyrG của A. niger và gen chỉ thị huỳnh quang đỏ DsRed (Hình 3.17B). Quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang, hệ sợi của tất cả các thể chuyển gen đều cho tín hiệu huỳnh quang đỏ mạnh (Hình 3.17C). Nhƣ vậy, gen huỳnh quang đỏ DsRed với marker trợ dƣỡng pyrG của A. niger đã đƣợc biểu hiện thành
Hình 3.17. Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed ở chủng A. oryzae RIB40 trợ dƣỡng
uridine/uracil. (A) PCR xác nhận với cặp mồi An-pyrG-P1/P2, (B) PCR xác nhận với cặp mồi DsRed-F/R, (C) Cấu trúc hệ sợi nấm dƣới kính hiển vi huỳnh quang Ở chủng VS1, đĩa chuyển gen thậm chí xuất hiện một số khuẩn lạc có màu hồng (Hình 3.16). Kết quả thu đƣợc khi PCR sử dụng cặp mồi DsRed-F/R là các chủng VS1 chuyển gen xuất hiện băng 730 bp, phù hợp với kích thƣớc gen DsRed,
đối chứng âm sử dụng DNA tổng số của chủng trợ dƣỡng không cho băng nào (Hình 3.18A). Ngồi ra, khi tiến hành quan sát hệ sợi của các thể chuyển gen VS1 dƣới kính hiển vi huỳnh quang, 100% các thể chuyển gen đƣợc chọn ngẫu nhiên quan sát cho tín hiệu huỳnh quang đỏ mạnh (Hình 3.18B).
Hình 3.18. Xác nhận chuyển gen DsRed vào A. oryzae VS1∆pyrG sử dụng vector
pEX2A. (A,B) PCR xác nhận gen DsRed 3 thể chuyển gen (V1,V2,V3) sử dụng cặp mồi AnpyrG-P1/P2 và DsRed-F/R, (B) Hệ sợi các thể chuyển gen dƣới kính hiển vi
Nhƣ vậy, gen huỳnh quang đỏ DsRed đã đƣợc biểu hiện thành công ở chủng nấm sợi A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil bằng phƣơng pháp chuyển gen nhờ