Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.5.2.Biểu hiện gen DsRed dƣới sự kiểm soát của promoter glaA thông qua
3.5. Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed dƣới sự kiểm soát của promoter glaA từ A.
3.5.2.Biểu hiện gen DsRed dƣới sự kiểm soát của promoter glaA thông qua
vector pEX2C
Vector pEX2C sau khi tạo thành đƣơc biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens theo phƣơng pháp biến nạp xung điện. Sau 3 - 4 ngày cấy trải trên môi trƣờng LB bổ sung kanamycin (100mg/l), chúng tôi thu đƣợc một số khuẩn lạc đơn. Bốn khuẩn lạc ngẫu nhiên đƣợc lựa chọn PCR với cặp mồi An-pro-glaA-F/R (Bảng 2.2). Kết quả cho thấy, tất cả các khuẩn lạc đƣợc chọn đều lên băng DNA có kích thƣớc 600 bp tƣơng ứng với kích thƣớc promoter glaA của nấm sợi A. niger. Đối chứng dƣơng sử dụng vector pEX2C cũng cho băng DNA kích thƣớc 600 bp. Đối chứng âm sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens không mang vector pEX2C không lên băng DNA nào (Hình 3.20).
Hình 3.20. Kết quả PCR kiểm tra 4 khuẩn lạc AGL1 biến nạp vector pEX2C theo
thứ tự Ag1, Ag2, Ag3, Ag4. Đối chứng (-) sử dụng vi khuẩn AGL1 không mang vector pEX2C. Đối chứng (+) sử dụng vector pEX2C
Nhƣ vậy tất cả các khuẩn lạc vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 đƣợc chọn đã nhận đƣợc vector pEX2C.
Chọn một khuẩn lạc đã kiểm tra để nuôi cấy và tiến hành chuyển gen vào hai chủng nấm mốc A. niger N402 và A. oryzae VS1 trợ dƣỡng theo các quy trình đã
thiết lập ở trên. Sau 3 - 5 ngày chuyển màng, trên đĩa môi trƣờng chọn lọc xuất hiện các thể chuyển gen mọc riêng rẽ. Trong khi đĩa đối chứng sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens không mang vector pEX2C không xuất hiện thể chuyển gen nào ở cả
hai chủng (Hình 3.21).
Các thể chuyển gen DsRed của chủng A. niger N402 đƣợc chọn lọc trên đĩa
môi trƣờng CD bổ sung kháng sinh cefotaxime (300 µg/ml) để diệt vi khuẩn A. tumefaciens. Chuyển gen vào chủng N402 trợ dƣỡng uridine/uracil với nồng độ 106
bào tử/ml chúng tôi thu đƣợc 57 - 81 thể chuyển gen/đĩa. Trong đó, một số thể chuyển gen của chủng A. niger N402 có màu hồng ngay trên đĩa chọn lọc. Thể chuyển gen của chủng VS1 đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng M + Met bổ sung cefotaxime (300 µg/ml). Kết quả chuyển gen vào chủng A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil thu đƣợc 6 - 8 thể chuyển gen/đĩa.
Các thể chuyển gen N402::DsRed sẽ đƣợc xác nhận bằng ba phản ứng PCR độc lập sử dụng 3 cặp mồi AopyrG-ORF-F/R, An-glaA-pro-F/R và DsRed-F/R. Với cặp mồi AopyrG-ORF-F/R, các thể chuyển gen lên băng xấp xỉ 900 bp tƣơng ứng với kích thƣớc khung đọc mở gen pyrG của A. oryzae (Hình 3.22A). Với cặp mồi An-glaA-pro-F/R các thể chuyển gen cho băng tƣơng ứng với kích thƣớc đoạn promoter glaA 600 bp (Hình 3.22C). Với cặp mồi Dsred-F/R, kết quả thu đƣợc ở
các thể chuyển gen là băng DNA với kích thƣớc 730 bp bằng với kích thƣớc gen
DsRed (Hình 3.22B). Đối chứng âm sử dụng DNA của chủng N402 trợ dƣỡng, kết
quả điện di không cho băng nào. Khi quan sát dƣới ánh sáng huỳnh quang, toàn bộ hệ sợi và bào tử của các thể chuyển gen phát ra tín hiệu huỳnh quang đỏ mạnh (Hình 3.22D). Nhƣ vậy, gen DsRed dƣới sự điều khiển của promoter glaA đã đƣợc chuyển thành công vào A. niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil.
Hình 3.22. Biểu hiện gen DsRed ở chủng nấm A. niger N402 trợ dƣỡng
uridine/uracil. (A, B,C) PCR xác nhận gen pyrG, DsRed và glaA ở bốn chủng chuyển gen N1, N2, N3, N4. M: Marker DNA 1kb. Đối chứng (+) sử dụng vector
pEX2C, đối chứng (-) sử dụng nƣớc cất vô trùng, (D) Hệ sợi nấm của các thể chuyển gen dƣới ánh sáng huỳnh quang
Các thể chuyển gen của chủng VS1 cũng đƣợc tiến hành xác nhận bằng PCR với hai cặp mồi An-glaA-pro-F/R và DsRed-F/R. Kết quả PCR ở tất cả chủng chuyển gen đều cho băng DNA tƣơng ứng với kích thƣớc của promoter glaA (600 bp) và gen DsRed (730 bp) (Hình 3.23A). Hệ sợi của các thể chuyển gen khi quan
sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang cho tín hiệu huỳnh quang đỏ rất mạnh (Hình 3.23D). Hơn nữa, các thể chuyển gen của chủng VS1 khi cấy trên mơi trƣờng CD có bổ sung 1% tinh bột, mặt sau của hệ sợi có màu hồng nhạt đến đậm (Hình 3.23C). Điều này có thể giải thích là do promoter glaA điều khiển hoạt động của gen DsRed là một promoter cảm ứng. Khi mơi trƣờng có bổ sung tinh bột, maltose sẽ cảm ứng hoạt động của promoter này khiến cho gen DsRed đƣợc biểu hiện mạnh, thậm chí dẫn đến kiểu hình đỏ có thể quan sát bằng mắt thƣờng. Nhƣ vậy, có thể kết luận gen huỳnh quang đỏ DsRed dƣới sự kiểm soát của promoter glaA của A. niger biểu hiện tốt ở chủng nấm A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil.
Hình 3.23. Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợi A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil.
(A,B) Xác nhận bằng PCR gen DsRed và glaA ở 4 chủng chuyển gen V1, V2, V3, V4, (C) Hệ sợi của các chủng chuyển gen có màu hồng khi ni cấy trên môi trƣờng CD bổ sung 1% tinh bột, (D) Hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử phát tín hiệu
huỳnh quang đỏ khá tốt khi quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang
Promoter glaA đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này là đoạn promoter của gen
glaA mã hóa cho enzyme glucoamylase A của A. niger. Các nghiên cứu trƣớc đây
chỉ ra rằng, glaA là một promoter cảm ứng, hoạt động mạnh khi mơi trƣờng ni
cấy có bổ sung tinh bột, glucose, maltose và bị ức chế biểu hiện khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy xylose [28, 29, 95]. Promoter glaA đã đƣợc đƣa vào nghiên
cứu biểu hiện protein tái tổ hợp và đã đƣợc sử dụng nhƣ một chiến lƣợc trong công nghiệp sản xuất enzyme từ A. niger, A. oryzae và một số loài Aspergillus khác.
Promoter glaA đã đƣợc sử dụng để biểu hiện thành công gen GFP ở A. niger sử
dụng phƣơng pháp chuyển gen bằng tế bào trần [33]. Trong nghiên cứu này, promoter glaA đƣợc sử dụng thay cho promoter gpdA cho kết quả biểu hiện gen cao
ở cả hai loài nấm sợi A. niger và A. oryzae. Đây là lần đầu tiên, gen DsRed dƣới sự điều khiển của promoter glaA từ A. niger đƣợc biểu hiện thành công ở A. oryzae và
A. niger bằng phƣơng pháp ATMT. Kết quả này một lần nữa chứng minh khả năng
hoạt động của promoter glaA ở các loài khác trong chi Aspergillus. Gen chỉ thị
huỳnh quang đỏ DsRed trong vector tạo đƣợc ở nghiên cứu này có thể đƣợc thay thế bằng các gen mã hóa cho enzyme hoặc protein mong muốn nhằm tăng cƣờng biểu hiện gen dƣới sự điều khiển của promoter glaA. Thêm vào đó kết quả chuyển gen
nhờ vi khuẩn Agrobacterium sử dụng vector pEX2C mang marker pyrG của A. oryzae cũng cho kết quả ấn tƣợng với chủng A. niger N402 (570 thể chuyển gen/106
bào tử) và chủng A. oryzae VS1 (70 thể chuyển gen/106 bào tử). Nghiên cứu này một lần nữa khẳng định khả năng hoạt động chéo của gen pyrG ở một số loài gần gũi trong chi Aspergillus. Việc sử dụng marker pyrG của A. oryzae làm marker trợ
dƣỡng trong chuyển gen vào nấm sợi A. niger bằng vi khuẩn A. tumefaciens là hoàn toàn khả thi.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Đã tạo đƣợc chủng A. niger trợ dƣỡng uridine/uracil bằng cách xóa gen pyrG để sử dụng cho các nghiên cứu chuyển gen vào lồi nấm này mà khơng sử dụng gen kháng kháng sinh.
2. Đã tạo thành công 3 vector nhị thể chứa marker chọn lọc là gen pyrG dùng
cho chuyển gen vào các chủng A. niger và A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil gồm: 1 vector xóa gen pyrG, 1 vector biểu hiện gen huỳnh qunag đỏ DsRed với marker là gen pyrG của A. niger, 1 vector biểu hiện gen huỳnh quang đỏ với marker trợ dƣỡng pyrG của A. oryzae và promoter glaA của A. niger. Các vector này đều hoạt động tốt khi chuyển vào chủng A. niger N402, A. oryzae VS1 và A. oryzae RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil.
3. Đã xây dựng đƣợc quy trình tối ƣu cho chuyển gen vào nấm sợi A. niger sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens và marker trợ dƣỡng pyrG.
4. Đã chứng minh đƣợc việc sử dụng chéo gen pyrG của A. oryzae làm marker trợ dƣỡng cho chuyển gen vào A. niger, và ngƣợc lại, sử dụng gen pyrG của
A. niger làm marker trợ dƣỡng chuyển gen vào A. oryzae thông qua việc biểu
hiện thành cơng gen mã hóa protein huỳnh quang DsRed.
5. Đã chứng minh đƣợc đoạn promoter glaA kích thƣớc 600 bp của A. niger có khả năng hoạt động tốt ở A. oryzae thông qua việc biểu hiện gen huỳnh
quang đỏ DsRed.
Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện một số enzyme/protein tái tổ hợp ở chủng A. niger trợ dƣỡng uridine/uracil sử dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Xuân Dung, Nguyễn Việt Khoa, Nguyễn Văn Tính, Trần Nguyễn Nhật Khoa, Lâm Thị Kim Chung (2012), "Tối ƣu hóa mơi trƣờng nuôi cấy
Aspergillus niger để tăng hiệu suất sản sinh phytase", Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 24: pp. 222-232.
2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), "Vi sinh vật học". Nhà xuất bản Giáo dục.
3. Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phƣơng Liên, Nông Văn Hải (2011), "Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học.
5(1): pp. 1-18.
4. Nguyễn Đức Thành, Lê Hồng Đức (2014), "Nhân dịng gen và vùng promoter
ubiquitin từ cây ngơ (Zae Mays L)", Tạp chí Sinh học. 35(3se): pp. 114-121.
5. Nguyễn Văn Thành, Trần Thị Yến Minh (2013), "Ứng dụng vi sinh vật và enzymer protease để cải thiện chất lƣợng nƣớc tƣơng lên men truyền thống.",
Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 26: pp. 205-212.
Tài liệu tiếng Anh
6. Acharya P., Acharya D., Modi H. (2008), "Optimization for cellulase production by Aspergillus niger using saw dust as substrate", African Journal of Biotechnology. 7(22).
7. Alam J., Cook J. L. (1990), "Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription", Analytical biochemistry. 188(2): pp. 245-
254.
8. Aluko R., McIntosh T. (2005), "Limited enzymatic proteolysis increases the level of incorporation of canola proteins into mayonnaise", Innovative Food Science & Emerging Technologies. 6(2): pp. 195-202.
10. Arora D. K. (1991), Handbook of Applied Mycology: Volume 1: Soil and Plants, CRC Press.
11. Baird G. S., Zacharias D. A., Tsien R. Y. (2000), "Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral",
Proceedings of the National Academy of Sciences. 97(22): pp. 11984-11989.
12. Beijersbergen, Alida Godelieve Maria Bundock, Paul Gouka, Robertus Johannes, De Groot, Marcellus Johannes Augustinus, Hooykaas, Jacob P. J.,
Agrobacterium mediated transformation of moulds, in particular those belonging to the genus Aspergillus 2001, Google Patents.
13. Beijersbergen A. G. M., Bundock P., Gouka R. J., De Groot M. J. A., Hooykaas P. J. J., Agrobacterium mediated transformation of moulds, in particular those belonging to the genus Aspergillus. 2001, Google Patents.
14. Bennett J. W. (2010), An overview of the genus Aspergillus, Caiser Academic
Press, Portland.
15. Bennett J. W., Klich M. A. (1992), Aspergillus: Biology and industrial applications, Butterworth-Heinemann Boston.
16. Bos C. J. (1986), "Induced mutation and somatic recombination as tools for genetic analysis and breeding of imperfect fungi".
17. Breakspear A., Langford K. J., Momany M., Assinder S. J. (2007), "CopA: GFP localizes to putative Golgi equivalents in Aspergillus nidulans", FEMS microbiology letters. 277(1): pp. 90-97.
18. Casselton L., Zolan M. (2002), "The art and design of genetic screens: filamentous fungi", Nature Reviews Genetics. 3(9): pp. 683-697.
19. Chakraborty B., Kapoor M. (1990), "Transformation of filamentous fungi by electroporation", Nucleic acids research. 18(22): pp. 6737.
20. Chang P.-K., Ehrlich K. C. (2010), "What does genetic diversity of Aspergillus
flavus tell us about Aspergillus oryzae?", International Journal of Food Microbiology. 138(3): pp. 189-199.
21. de Boer, Paulo Bronkhof, Jurian Dukiќ, Karolina Kerkman, Richard Touw, Hesselien van den Berg, Marco Offringa, Remko (2013), "Efficient gene targeting in Penicillium chrysogenum using novel Agrobacterium-mediated
transformation approaches", Fungal Genetics and Biology. 61: pp. 9-14. 22. De Groot M. J., Bundock P., Hooykaas P., Beijersbergen A. (1998),
"Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi",
Nature Biotechnology. 16.
23. Deacon J. W. (2013), Fungal biology, John Wiley & Sons.
24. Debets A. J., Holub E. F., Swart K., Broek H. W., Bos C. J. (1990), "An electrophoretic karyotype of Aspergillus niger", Molecular and General Genetics MGG. 224(2): pp. 264-268.
25. Elleuche S., Pöggeler S. (2009), "Visualization of peroxisomes via SKL-tagged DsRed protein in Sordaria macrospora", Bikarbonat-Stoffwechsel bei filamentösen Ascomyceten: pp. 8.
26. Fincham J. (1989), "Transformation in fungi", Microbiological Reviews. 53(1):
pp. 148-170.
27. Finkelstein D. B. (1987), "Improvement of enzyme production in Aspergillus",
Antonie Van Leeuwenhoek. 53(5): pp. 349-352.
28. Fowler T., Berka R. M., Ward M. (1990), "Regulation of the glaA gene of Aspergillus niger", Current genetics. 18(6): pp. 537-545.
29. Ganzlin M., Rinas U. (2008), "In-depth analysis of the Aspergillus niger
glucoamylase (glaA) promoter performance using high-throughput screening and controlled bioreactor cultivation techniques", Journal of Biotechnology.
135(3): pp. 266-271.
30. Geiser D., Klich M., Frisvad J. C., Peterson S., Varga J., Samson R. A. (2007), "The current status of species recognition and identification in Aspergillus", Studies in Mycology. 59: pp. 1-10.
31. Gelvin S. B. (2003), "Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the “gene-jockeying” tool", Microbiology and molecular biology reviews. 67(1): pp. 16-37.
32. Goosen T., van Engelenburg F., Debets F., Swart K., Bos K., van den Broek H. (1989), "Tryptophan auxotrophic mutants in Aspergillus niger: inactivation of the trpC gene by cotransformation mutagenesis", Molecular and General
Genetics MGG. 219(1-2): pp. 282-288.
33. Gordon C. L., Khalaj V., Ram A. F., Archer D. B., Brookman J. L., Trinci A. P., Jeenes D. J., Doonan J. H., Wells B., Punt P. J. (2000), "Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus
niger", Microbiology. 146(2): pp. 415-426.
34. Gouka R., Punt P., Van Den Hondel C. (1997), "Efficient production of secreted proteins by Aspergillus: progress, limitations and prospects", Applied microbiology and biotechnology. 47(1): pp. 1-11.
35. Gow N. A., Gadd G. M. (2007), Growing fungus, Springer Science & Business Media.
36. Grant S. G., Jessee J., Bloom F. R., Hanahan D. (1990), "Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation- restriction mutants", Proceedings of the National Academy of Sciences.
87(12): pp. 4645-4649.
37. Hanif M. (2004), "Characterization of small GTPase Cdc42 from the ectomycorrhizal fungus Suillus bovinus and Agrobacterium tumefaciens-
mediated transformation of fungi".
38. Hartingsveldt W., Mattern I. E., Zeijl C. M., Pouwels P. H., Hondel C. A. (1987), "Development of a homologous transformation system for
Aspergillus niger based on the pyrG gene", Molecular and General Genetics MGG. 206(1): pp. 71-75.
39. He L., Feng J., Lu S., Chen Z., Chen C., He Y., Yi X., Xi L. (2016), "Genetic Transformation of Fungi", International Journal of Developmental Biology.
40. Hoekema A., Hirsch P., Hooykaas P., Schilperoort R. (1983), "A binary plant vector strategy based on separation of vir-and T-region of the Agrobacterium
tumefaciens Ti-plasmid".
41. Hong S.-B., Hong S.-Y., Jo K.-H., Kim Y.-S., Do J.-H., Do J.-Y., Noh S.-B., Yoon H.-H., Chung S.-H. (2015), "Taxonomic Characterization and Safety of Nuruk Molds Used Industrially in Korea", The Korean Journal of Mycology. 43(3): pp. 149-157.
42. Houbraken J., Frisvad J. C., Samson R. A. (2011), "Fleming's penicillin producing strain is not Penicillium chrysogenum but P. rubens", IMA fungus. 2(1): pp. 87-95.
43. Imanaka H., Tanaka S., Feng B., Imamura K., Nakanishi K. (2010), "Cultivation characteristics and gene expression profiles of Aspergillus oryzae by membrane-surface liquid culture, shaking-flask culture, and agar-plate culture", Journal of Bioscience and Bioengineering. 109(3): pp. 267-273. 44. Janus D., Hoff B., Hofmann E., Kück U. (2007), "An efficient fungal RNA-
silencing system using the DsRed reporter gene", Applied and Environmental
Microbiology. 73(3): pp. 962-970.
45. Jørgensen T. R., Nielsen K. F., Arentshorst M., Park J., van den Hondel C. A., Frisvad J. C., Ram A. F. (2011), "Submerged conidiation and product formation by Aspergillus niger at low specific growth rates are affected in
aerial developmental mutants", Applied and Environmental Microbiology.
77(15): pp. 5270-5277.
46. Kanamasa S., Yamaoka K., Kawaguchi T., SUMITANI J.-i., ARAI M. (2003), "Transformation of Aspergillus aculeatus using the drug resistance gene of
Aspergillus oryzae and the pyrG gene of Aspergillus nidulans", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 67(12): pp. 2661-2663.
47. Kandušer M., Miklavčič D., Electroporation in biological cell and tissue: an overview, in Electrotechnologies for extraction from food plants and biomaterials. 2009, Springer. p. 1-37.
48. Khalaj V., Azizi M., Enayati S., Khorasanizadeh D., Ardakani E. M. (2012), "NCE102 homologue in Aspergillus fumigatus is required for normal
sporulation, not hyphal growth or pathogenesis", FEMS Microbiology letters. 329(2): pp. 138-145.
49. Kitamoto K. (2015), "Cell biology of the Koji mold Aspergillus oryzae", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 79(6): pp. 863-869.