Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.5. Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen
Tạo vector xóa gen pyrG ở A. niger
Gen pyrG đƣợc khuếch đại bằng PCR với khuôn là DNA hệ gen từ chủng A.
niger N402 với cặp mồi An-pyrG-P1/P2 (Bảng 2.2) có trình tự nhận biết của
enzyme giới hạn XbaI. Phản ứng PCR sử dụng enzyme Phusion® high-fidelity DNA polymerase với chu trình nhiệt nhƣ sau: 94ºC/ 6 phút; 35 chu kỳ lặp lại các bƣớc 94ºC/ 30 giây, 58ºC/ 30 giây, 72ºC/ 2 phút; 72ºC/ 10 phút, giữ ở 4ºC.
Cấu trúc xóa gen pyrG ở A. niger đƣợc thiết kế dựa trên khung của vector
nhị thể pKO2. Đoạn pyrG sau khi tinh sạch đƣợc cắt bởi enzyme XbaI, tiếp đó đƣợc nối vào vector pKO2 đã đƣợc cắt bằng 2 enzyme EcoRV và XbaI. Việc ghép nối sử dụng enzyme T4 DNA ligase theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Cấu trúc xóa gen
pyrG đƣợc tạo bằng cách cắt vector mang gen pyrG nguyên gốc bằng 2 enzyme giới
hạn là EcoRV và BamHI, sau đó tiến hành làm bằng đầu và ghép nối để vector tự
đóng vịng bằng enzyme blunting có trong bộ kit ClonJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific) theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Cấu trúc xóa mang đoạn gen
pyrG có kích thƣớc nhỏ hơn gen pyrG nguyên gốc là 564 bp.
Cấu trúc vector pEX2A đƣợc thiết kế dựa trên khung của vector nhị thể pEX2 mang gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed và marker chọn lọc là gen
pyrG của A. niger.Vector pEX2 đƣợc cắt bởi hai enzyme EcoRI và SpeI, sản phẩm
cắt đƣợc điện di trên gel 0,7% trong 30 phút ở 90V, cắt lấy đoạn gel có chứa băng DNA kích thƣớc 8,1 kb, tinh sạch đoạn DNA khung vector bằng kit tinh sạch DNA từ gel agarose theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Gen pyrG đƣợc PCR từ DNA tổng số, sau đó đƣợc cắt bằng enzyme EcoRI và XbaI và tinh sạch. Đoạn pyrG sau khi tinh sạch đƣợc nối vào khung vector pEX2 bằng enzyme T4 DNA ligase theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Vector sau khi tạo đƣợc cắt kiểm tra bằng enzyme
XhoI, theo tính tốn lý thuyết thì sản phẩm cắt sẽ gồm ba băng DNA với kích thƣớc
tƣơng ứng là 1,28 kb; 2,35 kb và 8,29 kb.
Tạo vector biểu hiện huỳnh quang đỏ pEX2C
Cấu trúc vector pEX2C cũng đƣợc thiết kế dựa trên khung vector nhị thể pEX2 để biểu hiện gen DsRed dƣới sự điều khiển của promoter glaA từ A. niger và
marker chọn lọc là gen pyrG của A. oryzae. Sử dụng 2 enzyme SpeI và XhoI để cắt vector pEX2, sau đó điện di tinh sạch để thu đƣợc đoạn DNA khung vector kích thƣớc 10 kb. Promoter glaA đƣợc PCR từ hệ gen của A. niger sử dụng enzyme
Phusion high - fidelity DNA polymerase với chu trình nhiệt nhƣ sau: 94ºC/ 6 phút; 35 chu kỳ lặp lại các bƣớc 94ºC/ 30 giây, 58ºC/ 30 giây, 72ºC/ 1 phút; 72ºC/ 10 phút, giữ ở 4ºC. Promoter glaA sau đó đƣợc cắt bởi 2 enzyme SpeI, XhoI và tinh
sạch bằng kit tinh sạch DNA. Đoạn glaA sau khi tinh sạch đƣợc nối vào khung
vector pEX2 bằng enzyme T4 DNA ligase theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Vector sau khi tạo thành đƣợc cắt kiểm tra bằng enzyme EcoRI sẽ cho kết quả theo tính
tốn lý thuyết là 2 băng với kích thƣớc là 2,22 kb và 8,4 kb.