Xử lý enzyme giới hạn

Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.4. Xử lý enzyme giới hạn

 Cắt enzyme giới hạn:

Khung vector nhị thể trƣớc khi nối các đoạn DNA cần thiết phải đƣợc xử lý với enzyme cắt giới hạn. Quy trình cắt enzyme giới hạn với tổng thế tích 20 µl gồm các thành phần nhƣ sau:

 Vector : 4 µl  FastDigest buffer : 2 µl  Enzyme 1 : 1 µl  Enzyme 2 : 1 µl  Nuclease free water : 12 µl

Các thành phần trên đƣợc trộn đều trong ống eppendorf 1,5 ml, ủ ở 37oC trong 40 phút sau đó đƣợc điện di trên gel agarose, cắt băng DNA tƣơng ứng và tinh sạch bằng kit để thu đƣợc phần khung vector đã xử lý enzyme.

Các đoạn DNA nối (Insert) cũng đƣợc xử lý với enzyme giới hạn tƣơng thích theo quy trình tƣơng tự. Tổng thể tích cắt 20 µl bao gồm các thành phần:

 Insert : 10 µl  Fast Digest buffer : 2 µl  Enzyme 1 : 1 µl  Enzyme 2 : 1 µl  Nuclease free water : 6 µl

 Nối đoạn insert vào khung vector:

Khung vector và đoạn insert sau khi xử lý enzyme giới hạn sẽ đƣợc tiến hành lai ghép (ligation). Thành phần phản ứng nối với tổng thể tích 20 µl bao gồm:

 Vector : 3 µl  Insert : 10 µl  T4 DNA ligase buffer 10X: 2 µl  T4 DNA ligase : 1 µl  Nuclease free water : 4 µl

Các thành phần phản ứng đƣợc trộn với nhau trong ống eppendorf 1,5 ml, bọc giấy bạc và ủ ở 4oC qua đêm sau đó biến nạp vào E. coli để phục vụ cho các

bƣớc tiếp theo của thí nghiệm.

 Xử lý với enzyme làm bằng đầu:

Đối với tạo vector xóa pyrG yêu cầu sử dụng enzyme làm bằng đầu (DNA

blunting enzyme có trong bộ kit CloneJET PCR Cloning Kit), tổng thể tích cắt 20 µl bao gồm :

 2x reaction buffer : 10 µl  Vector pKO2 : 5 µl  Nuclease free water : 3 µl  DNA blunting enzyme : 1 µl

Trộn các thành phần trên trong ống eppendorf 1,5 sau đó voltex nhanh và ly tâm 3 - 5 giây, ủ ở 70o C trong 5 phút. Giữ ống eppendorf trên đá lạnh, bổ sung thêm 1 µl T4 ligase enzyme sau đó bọc giấy bạc ủ ở 4oC qua đêm.

 Cắt kiểm tra vector

Bƣớc cuối cùng của quá trình tạo vector là cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn. Mỗi vector sẽ đƣợc cắt kiểm tra bằng một hoặc hai, ba enzyme có trình tự nhận biết trên khung vector và trong đoạn insert. Quy trình cắt enzyme kiểm tra tƣơng tự

với quy trình cắt enzyme tạo vector. Tổng thể tích cắt enzyme kiểm tra 10 µl với các thành phần:  Vector : 10 µl  FastDigest buffer : 1 µl  Enzyme 1 : 1 µl  Enzyme 2 : 1 µl  Nuclease free water : 1 µl

Sản phẩm cắt enzyme sau khi ủ ở 37o C trong 40 phút sẽ đƣợc điện di để kiểm tra kết quả.