CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.3. Thực nghiệm
2.3.3. Thử hoạt tính sinh học
2.3.3.1. Phương pháp thử hoạt tính ức chế α-glucosidase [38] a. Nguyên tắc
Enzyme α-glucosidase khi gặp liên kết α-O-glycoside sẽ cắt đứt liên kết này để giải phóng đường D-glucose. Sử dụng cơ chất có liên kết α với đường D-glucose như p- nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG), dưới tác dụng của enzyme α-glucosidase sẽ bị thủy phân cho ra đường D-glucose và p-nitrophenol. p-Nitrophenol hấp thu trong vùng ánh sáng nhìn thấy được, nên tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 405 nm. Từ đó xác định được lượng D-glucose sinh ra.
b. Phương pháp tiến hành
Ü Chuẩn bị các dung dịch
-Enzyme được pha ở nồng độ 1,0 U/mL.
-Cơ chất pNPG được pha ở nồng độ 20 mM trong đệm phosphate pH 6,9; 5
mM trong đệm phosphate pH 6,8; 5 mM trong đệm phosphate pH 6,9.
-Dung dịch đệm phosphate pH 6,9; pH 6,8.
-Chất ức chế dương (đối chứng dương) được sử dụng là acarbose. -Các mẫu ức chế được pha ở các nồng độ khác nhau.
Ü Thực hiện phản ứng
-Trộn lẫn các dung dịch gồm dung dịch đệm, enzyme, chất ức chế với thể tích
nhất định.
-Hoạt hóa hỗn hợp ở 37oC trong 20 phút; 25oC trong 5 phút.
-Kết thúc phản ứng bằng cách thêm Na2CO3 ở nồng độ 0,1 M.
-Đo độ hấp thu của các mẫu ở bước sóng 405 nm, dựa vào đường chuẩn để xác
định lượng glucose sinh ra, từ đó xác định % ức chế và suy ra chỉ số IC50.
c. Tính kết quả
Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với p-nitrophenol. Vì vậy có thể đo độ hấp thu cực đại của p-nitrophenol để xác định lượng glucose sinh ra. So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu có ức chế (mẫu thử) và mẫu không ức chế (mẫu chuẩn) để xác định % ức chế Ia-Glu (%).
Ia-Glu (%) = !!" !# x 100%
!! Trong đó:
Ac: Giá trị độ hấp thu của mẫu khơng ức chế (mẫu chuẩn) As: Giá trị độ hấp thu của mẫu có ức chế (mẫu thử)
Dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định chỉ số IC50.
2.3.3.2. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào [59] a. Nguyên tắc
Các dòng tế bào khối u MCF-7, HepG2 và K562 được nuôi và cấy vào mơi trường có chứa hoạt chất theo dãy nồng độ, sau đó đo lượng tế bào sống sót để đánh giá hoạt tính của mẫu chất.
b. Phương pháp tiến hành
Ü Chuẩn bị môi trường và các dung dịch
Môi trường: RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute) hoặc DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), bổ sung 10% FBS (Fetal Bovine Serum), penicillin 100 IU/mL và streptomycin 100 μg/mL; duy trì ở 37oC, CO2 5% và độ ẩm 95%.
Đối chứng dương: Thuốc chống ung thư doxorubicin pha trong DMSO. Đối chứng âm: DMSO.
Các dung dịch: DMSO (Dimethyl Sulfoxide), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). Dung dịch MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 5 mg/mL pha trong PBS (Phosphate Buffered Saline).
Ü Cách tiến hành
Các tế bào sống được đã được đếm và cấy vào đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào/100 μl/giếng đối với MCF-7, HepG2 và 105 tế bào/100 μl/giếng đối với K562.
Sau 24 giờ, các tế bào được xử lý bằng mẫu thử và doxorubicin (đối chứng dương) được pha lỗng trong mơi trường ni cấy ở nồng độ 100, 50, 25, 12,5; 6,25; 3,125 và 0 μg/mL tương ứng 1%, 0,5%; 0,25%; 0,125%; 0,0625%; 0,03125% và 0%. DMSO trong môi trường nuôi cấy được sử dụng như một đối chứng âm và mơi trường ni cấy khơng có tế bào được sử dụng làm mẫu trắng. Tất cả các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần.
Các đĩa được ủ ở 37oC, CO2 5% và độ ẩm 95% trong 72 giờ. Sau đó, thêm vào mỗi giếng 10 μl MTT 5 mg/mL và ủ ở 37oC, CO2 5% trong 3,5 giờ. Thêm vào mỗi giếng 70 μl SDS 10% và ủ ở 37oC trong 16 giờ. Đo độ hấp thu của mỗi giếng bằng máy quang phổ quét Sunrise ở bước sóng 595 nm.
c. Tính kết quả
Giá trị CS: Tỷ lệ sống sót của tế bào được đo bằng tỷ lệ phần trăm độ hấp thụ so với đối chứng âm tính (DMSO).
CS (%) = !#" !$%&' x 100%
!! " !
$%&' Trong đó:
Ac: Giá trị độ hấp thu của mẫu chứng dương As: Giá trị độ hấp thu của mẫu thử
ADMSO: Giá trị độ hấp thu của mẫu chứng âm
Dựng đường biểu diễn giữa %CS và nồng độ mẫu thử để xác định chỉ số IC50.