CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.8. Tóm lược tình hình nghiên cứu về chi Nervilia
Các nghiên cứu về thành phần hoá học của cây một lá thuộc chi Nervilia được cơng bố chủ yếu từ lồi N. fordii ở Trung Quốc và N. aragoana Gaud. ở Ấn Độ. Chi
Nervilia phát hiện khoảng 71 hợp chất trong đó có 27 flavonoid, 12 triterpenoid, 7 sterol
và những hợp chất khác (acid béo, amino acid và rượu). Các flavonoid phân lập được từ chi Nervilia hầu hết thuộc hai nhóm flavone và flavonol. Phần đường chủ yếu là D-
glucose, D-xylose, ít gặp hơn là D-galactose; các glycoside này đa số gắn ở vị trí C3, C6, C7, C8 và C4'; số lượng gắn vào khung aglycone từ 1-2 đơn vị; các đường gắn vào C3, C4' đều có cấu hình β. Các triterpenoid phân lập được từ chi Nervilia chủ yếu có khung cycloartane, trên đó vị trí C28 là gốc carboxyl, C1 và C25 được gắn nhóm hydroxyl, C3 gắn với đường là D-glucose hoặc D-xylose cả hai loại này đều có cấu hình β.
Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của chi Nervilia được công bố chủ yếu ở Trung Quốc và Ấn Độ. Chi Nervilia có tác dụng kháng viêm cải thiện hệ miễn dịch, kháng ung thư, kháng oxy hóa, kháng khuẩn; đặc biệt có tác dụng hiệu quả trong việc làm hạ đường huyết của chuột thử nghiệm cho thấy khả năng điều trị đái tháo đường loại 2. Ngoài ra, các flavonoid phân lập được từ chi này tác dụng điều trị đối với bệnh xơ phổi nhờ vào việc kiểm soát sản xuất cytokine.
Từ kết quả tổng hợp trên cho thấy các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của chi Nervilia được công bố chủ yếu ở Trung Quốc và Ấn Độ, ở Việt Nam chưa tìm thấy báo cáo nào của chi Nervilia thuộc họ Lan Trân Châu (Orchidaceae). Đồng thời, các kết quả công bố trên giúp định hướng trong nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất, cũng như trong nghiên cứu hoạt tính sinh học của cây một lá N. aragoana.
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Cây một lá N. aragoana Gaud., tên gọi khác N. concolor (Blume) Schltr., Pogonia
flabelliformis Lindl.; tên khoa học được giám định bởi PGS.TS. Trần Hợp (Viện Sinh học
Nhiệt Đới, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Mẫu tiêu bản (mã số NA- 0621) được lưu tại Trung tâm Sâm và Dược liệu, Viện Dược liệu.
Mẫu cây một lá sử dụng trong nghiên cứu là toàn cây, được thu thập tại huyện Cư M’gar, tỉnh Đắk Lắk. Nguyên liệu tươi sau khi loại bỏ phần sâu bệnh, hư hỏng; được rửa sạch, phơi khô và xay thành bột mịn; bột cây một lá được sử dụng trong nghiên cứu.
Hình 2.1. Cây một lá N. aragoana Gaud.
2.1.2. Vật liệu, hóa chất
Dung mơi hữu cơ: n-hexane, CHCl3, EtOAc, EtOH, MeOH (Chemsol, Việt Nam và Xilong, Trung Quốc).
H2SO4 (Guanghua, Trung Quốc).
Chất hấp phụ silica gel pha thường 230-400 mesh (HiMedia, Ấn Độ), pha đảo RP- 18(Merck, Đức), hạt Diaion HP-20 (Mitsubishi, Nhật) và Sephadex LH-20 (Sigma, Đức). Bản silica gel tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254, RP-18 F254s (Merck, Đức).
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ
Máy cô quay chân không Buchi R-210 (Thuỵ Sĩ), tủ hút Memmert (Đức), cân phân tích GR-200 và cân kỹ thuật GM-612 (Nhật), đèn UV Mineralight® Lamp, máy sấy cầm tay, bếp điện từ.
Máy ghi phổ NMR Bruker AM500 FT-NMR (Mỹ), máy đo phổ khối ESI-MS Bruker MicroTOF-QII (Đức).
Các loại cột sắc ký, dụng cụ thủy tinh (bình lóng, bình cầu, cốc, ống đong…).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp chiết xuất
Phương pháp ngâm chiết: Ngâm ngập nguyên liệu trong dung mơi ở nhiệt độ phịng, dịch chiết được lọc qua giấy lọc và cô quay chân không dưới áp suất thấp thu hồi cao chiết tổng.
Phương pháp chiết lỏng-lỏng: Sử dụng bình lóng để điều chế các loại cao chiết phân đoạn từ cao chiết tổng.
2.2.2. Phương pháp phân lập
Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm; pha đảo RP-18 và sử dụng chất nhồi cột là nhựa trao đổi ion hạt Diaion HP-20 và Sephadex LH-20.
Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng thực hiện trên bản silica gel tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254, RP-18 F254s. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại Mineralight® Lamp ở hai bước sóng 254 và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong EtOH phun đều lên bản mỏng, sấy khơ rồi hơ nóng trên bếp điện từ đến khi hiện màu.
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc
Khối phổ (MS): Phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao một lần (HR-ESI- MS) được đo trên máy Bruker MicroTOF-QII spectrometer và máy Shimadzu IT-TOF tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. HCM.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR (sử dụng TMS làm chất nội chuẩn) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phương pháp xác suất phân bố (DP4+): Phân tích các cấu trạng của hợp chất được thực hiện bằng phần mềm Tinker v8.6.1 và phần mềm Gaussian 16, tính tốn độ dịch
chuyển của NMR được thực hiện bằng phương pháp GIAO. Phương pháp DP4+ được tiến hành tại Trường Đại học Chulalongkorn, Thái Lan và tại Trường Đại học Quy Nhơn.
2.2.4. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.2.4.1. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase
Phương pháp sử dụng enzyme α-glucosidase thu từ loài S. cerevisiae (G0660- 750UN, Sigma, Đức), chất nền p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (Sigma, Đức), đối chứng dương acarbose (Sigma, Đức). Đo mật độ quang trên máy Shimadzu UV1800 (Shimadzu, Nhật) tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2.4.2. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào (phương pháp MTT)
Phương pháp sử dụng đối chứng dương doxorubicin 10 mg/5mL (Ebewe, Áo), dòng tế bào khối u MCF-7, HepG2 và dòng K562. Đo độ hấp thu trên máy quang phổ quét Sunrise (Sunrise, Đức) của Phịng Thí nghiệm Sinh học Phân tử, Bộ mơn Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh và Trường Đại học Nguyễn Tất Thành.
2.3. Thực nghiệm
2.3.1. Điều chế các cao chiết
Bột toàn cây một lá N. aragoana (4 kg) được trích kiệt trong EtOH 96% ở nhiệt độ phịng, lọc tách bã, dịch chiết đem cơ quay dưới áp suất thấp thu hồi dung môi, thu được cao thô EtOH dạng sệt (280 g). Cao thô EtOH được thêm nước, chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung mơi n-hexane, CHCl3, EtOAc. Sau đó các dịch chiết được đem cơ quay thu hồi dung môi, thu được các cao tương ứng: Cao n-hexane (110 g), cao CHCl3 (25 g), cao EtOAc (90 g) và cao nước (45 g). Quá trình thực hiện được trình bày theo Sơ đồ 2.1.
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ điều chế các loại cao chiết từ bột toàn cây N. aragoana
2.3.2. Phân lập các hợp chất
2.3.2.1. Các hợp chất từ cao CHCl3 – NA.C
Cao NA.C (25,0 g) tiến hành CC-SC pha thường, rửa giải với hệ dung môi tăng dần độ phân cực n-hexane-EtOAc tỉ lệ thay đổi từ 50/1→0/1, thu được 6 phân đoạn C.1-C.6.
Phân đoạn C.2 (2,8 g) tiến hành CC-SC pha thường với hệ dung môi tăng dần độ phân cực n-hexane-EtOAc tỉ lệ thay đổi từ 30/1→0/1, thu được 3 phân đoạn C.2.1-C.2.3. Phân đoạn C.2.2 ( g) được CC-SC rửa giải bằng hệ dung môi tăng dần độ phân cực n- hexane-EtOAc tỉ lệ thay đổi từ 20/1→0/1, thu được 4 phân đoạn C.2.2.1-C.2.2.4. Tinh chế phân đoạn C.2.2.2 bằng CC-SC thu được NA.07 (12 mg). Phần C.2.2.3 được tinh chế bằng CC-SC sử dụng chất rửa giải là n-hexane-EtOAc (5/1) thu được hai hợp chất NA.04 (26,0 mg) và NA.06 (17,0 mg).
Phân đoạn C.3 (3,4 g) được CC-SC pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane- acetone (20/1, 10/1, 5/1, 1/1) thu được 4 phân đoạn C.3.1-C.3.4. Hợp chất NA.05 (12,0 mg) và NA.09 (15,0 mg) thu được từ C.3.2 bằng CC-SC pha thường. Phân đoạn C.3.3 tiếp tục
được CC-SC và rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane-acetone (15/1, 10/1, 5/1, 1/1) thu được
2 phân đoạn C.3.3.1-C.3.3.2. Hợp chất NA.08 (8,0 mg) và NA.10 (14,0 mg) được tinh chế từ phân đoạn C.3.3.2.
Phân đoạn C.5 (6,2 g) được điều chế bằng CC-SC pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi của CHCl3-MeOH (20/1, 10/1, 5/1, 1/1) thu được 3 phân đoạn C.5.1-C.5.3. Phân đoạn C.5.2 được CC-SC nhiều lần sử dụng hệ dung môi CHCl3-MeOH (10/1) thu được NA.11 (10,0 mg). Hợp chất NA.03 (6,0 mg) được tinh chế từ phân đoạn C.5.3 bằng CC-SC pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3-MeOH (7/1).
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao NA.C 2.3.2.2. Các hợp chất từ cao EtOAc – NA.E
Cao NA.E (90,0 g) tiến hành CC-SC pha thường rửa giải với hệ dung môi tăng dần độ phân cực CHCl3-MeOH (50/1, 20/1, 15/1, 10/1, 5/1, 1/1, 0/100), thu được 7 phân đoạn lần lượt là E.1 (4,5 g), E.2 (10,0 g), E.3 (15,0 g), E.4 (12,0 g), E.5 (20,0 g), E.6 (15,0 g), E.7 (8,5 g).
Phân đoạn E.2 (10,0 g) tiến hành CC-SC pha thường rửa giải ly với hệ dung môi CHCl3-MeOH (20/1, 15/1, 10/1, 5/1, 1/1, 0/100) thu được 5 phân đoạn E.2.1-E.2.5. Ở phân đoạn E.2.2 (2,0 g) được CC-SC lặp lại nhiều lần với hệ dung môi giải ly CHCl3-MeOH (20/1) thu được hợp chất NA.12 (20,0 mg). Tương tự phân đoạn E.2.3 (1,8 g) CC-SC lặp lại nhiều lần với hệ dung môi CHCl3-MeOH (15/1) thu được hợp chất NA.16 (17,0 mg).
Phân đoạn E.4 (12,0 g) tiến hành CC-SC pha thường rửa giải ly với hệ dung môi CHCl3-MeOH (15/1, 10/1, 5/1, 1/1, 0/100) thu được 5 phân đoạn E.4.1-E.4.5. Ở phân đoạn E.4.1 (1,5 g) được CC-SC lặp lại nhiều lần với hệ dung môi giải ly CHCl3-MeOH (20/1) thu được 3 phân đoạn E.4.1.1-E.4.1.3. Ở phân đoạn E.4.1.2 (0,9 g) tiến hành CC- SC lặp lại nhiều lần với hệ dung môi giải ly CHCl3-MeOH (15/1) thu được hợp chất
NA.15 (32,0 mg) và hợp chất NA.19 (10,0 mg). Phân đoạn E.4.3 (3,1 g) tiếp tục CC-SC
lặp lại nhiều lần với hệ dung môi giải ly CHCl3-MeOH (10/1) thu được 3 phân đoạn E.4.3.1-E.4.3.3. Ở phân đoạn E.4.3.2 (1,2 g) được CC-SC lặp lại nhiều lần với hệ dung môi giải ly CHCl3-MeOH-H2O (10/1/0,1) thu được hợp chất NA.24 (14,0 mg) và hợp chất
NA.25 (26,0 mg). Tương tự phân đoạn E.4.5 (3,8 g) CC-SC lặp lại nhiều lần với hệ dung
môi giải ly CHCl3-MeOH (10/1) thu được 3 phân đoạn E.4.5.1-E.4.5.3. Ở phân đoạn E.4.5.2 (1,6 g) CC-SC lặp lại nhiều lần với hệ dung môi giải ly CHCl3-MeOH-H2O (10/1/0,1) thu được hợp chất NA.20 (23,0 mg) và hợp chất NA.21 (14,0 mg). Ở phân
đoạn E.4.5.3 (1,1 g) CC-SC lặp lại nhiều lần với hệ dung môi giải ly CHCl3-MeOH-H2O (10/1/0,1) thu được hợp chất hợp chất NA.22 (17,0 mg).
Phân đoạn E.5 (20,0 g) tiến hành CC-SC pha thường giải ly lần lượt với hệ dung môi CHCl3-MeOH (15/1, 10/1, 7/1, 5/1, 1/1, 0/100). Dựa trên kết quả TLC với thuốc thử H2SO4 10%/EtOH để hiện hình, gom các vết giống nhau thu được 5 phân đoạn ký hiệu là E.5.1-E.5.5. Từ phân đoạn E.5.1 (3,2 g) tiến hành CC-SC pha thường giải ly nhiều lần với hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O (10/1/0,1) thu được hợp chất NA.01 (10,0 mg) và NA.02 (14,0 mg). Từ phân đoạn E.5.2 (4,5 g) tiến hành CC-SC với hệ dung môi giải ly CHCl3- MeOH-H2O (10/1/0,1), kết quả thu được các hợp chất NA.14 (18,0 mg) và NA.23 (8,0
mg). Từ phân đoạn E.5.4 (2,2 g) tiến hành CC-SC pha thường với hệ dung môi giải ly CHCl3-MeOH-H2O (7/1/0,1→3/1/0,1) dựa trên kết quả TLC gom các vết giống nhau thu được 3 phân đoạn ký hiệu là E.5.4.1-E.5.4.3. Phân đoạn E.5.4.2 được CC-SC pha đảo RP- 18 với hệ dung môi giải ly MeOH-H2O (1/1) thu được hợp chất NA.13 (8,0 mg).
Sơ đồ 2.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao NA.E
Phân đoạn E.6 (15,0 g) được tiến hành CC-SC pha thường giải ly lần lượt với hệ dung môi CHCl3-MeOH (10/1, 7/1, 5/1, 3/1, 1/1, 0/100). Dựa trên kết quả TLC gom các vết giống nhau thu được 5 phân đoạn ký hiệu là E.6.1-E.6.5. Từ phân đoạn E.6.3 (2,8 g) tiến hành CC-SC nhiều lần với hệ dung môi giải ly CHCl3-MeOH-H2O (5/1/0,1) kết quả thu được hợp chất NA.18 (15,0 mg). Từ phân đoạn E.6.4 (2,2 g) tiến hành CC-SC nhiều lần với hệ dung môi giải ly CHCl3-MeOH-H2O (7/1/0,1→3/1/0,1) kết quả thu được 3 phân đoạn ký hiệu E.6.4.1-E.6.4.3. Từ phân đoạn E.6.4.2 (0,5 g) CC-SC nhiều lần với hệ dung môi giải ly CHCl3-MeOH-H2O (5/1/0,1), tiếp tục tiến hành CC-SC pha đảo RP-18 với hệ dung môi giải ly MeOH-H2O (1/2) thu được hợp chất NA.17 (11,0 mg).
2.3.3. Thử hoạt tính sinh học
2.3.3.1. Phương pháp thử hoạt tính ức chế α-glucosidase [38] a. Nguyên tắc
Enzyme α-glucosidase khi gặp liên kết α-O-glycoside sẽ cắt đứt liên kết này để giải phóng đường D-glucose. Sử dụng cơ chất có liên kết α với đường D-glucose như p- nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG), dưới tác dụng của enzyme α-glucosidase sẽ bị thủy phân cho ra đường D-glucose và p-nitrophenol. p-Nitrophenol hấp thu trong vùng ánh sáng nhìn thấy được, nên tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 405 nm. Từ đó xác định được lượng D-glucose sinh ra.
b. Phương pháp tiến hành
Ü Chuẩn bị các dung dịch
-Enzyme được pha ở nồng độ 1,0 U/mL.
-Cơ chất pNPG được pha ở nồng độ 20 mM trong đệm phosphate pH 6,9; 5
mM trong đệm phosphate pH 6,8; 5 mM trong đệm phosphate pH 6,9.
-Dung dịch đệm phosphate pH 6,9; pH 6,8.
-Chất ức chế dương (đối chứng dương) được sử dụng là acarbose. -Các mẫu ức chế được pha ở các nồng độ khác nhau.
Ü Thực hiện phản ứng
-Trộn lẫn các dung dịch gồm dung dịch đệm, enzyme, chất ức chế với thể tích
nhất định.
-Hoạt hóa hỗn hợp ở 37oC trong 20 phút; 25oC trong 5 phút.
-Kết thúc phản ứng bằng cách thêm Na2CO3 ở nồng độ 0,1 M.
-Đo độ hấp thu của các mẫu ở bước sóng 405 nm, dựa vào đường chuẩn để xác
định lượng glucose sinh ra, từ đó xác định % ức chế và suy ra chỉ số IC50.
c. Tính kết quả
Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với p-nitrophenol. Vì vậy có thể đo độ hấp thu cực đại của p-nitrophenol để xác định lượng glucose sinh ra. So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu có ức chế (mẫu thử) và mẫu không ức chế (mẫu chuẩn) để xác định % ức chế Ia-Glu (%).
Ia-Glu (%) = !!" !# x 100%
!! Trong đó:
Ac: Giá trị độ hấp thu của mẫu khơng ức chế (mẫu chuẩn) As: Giá trị độ hấp thu của mẫu có ức chế (mẫu thử)
Dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định chỉ số IC50.
2.3.3.2. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào [59] a. Nguyên tắc
Các dòng tế bào khối u MCF-7, HepG2 và K562 được nuôi và cấy vào mơi trường có chứa hoạt chất theo dãy nồng độ, sau đó đo lượng tế bào sống sót để đánh giá hoạt tính của mẫu chất.
b. Phương pháp tiến hành
Ü Chuẩn bị môi trường và các dung dịch
Môi trường: RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute) hoặc DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), bổ sung 10% FBS (Fetal Bovine Serum), penicillin 100 IU/mL và streptomycin 100 μg/mL; duy trì ở 37oC, CO2 5% và độ ẩm 95%.
Đối chứng dương: Thuốc chống ung thư doxorubicin pha trong DMSO. Đối chứng âm: DMSO.
Các dung dịch: DMSO (Dimethyl Sulfoxide), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). Dung dịch MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 5 mg/mL pha trong PBS (Phosphate Buffered Saline).
Ü Cách tiến hành
Các tế bào sống được đã được đếm và cấy vào đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào/100 μl/giếng đối với MCF-7, HepG2 và 105 tế bào/100 μl/giếng đối với K562.
Sau 24 giờ, các tế bào được xử lý bằng mẫu thử và doxorubicin (đối chứng dương) được pha lỗng trong mơi trường ni cấy ở nồng độ 100, 50, 25, 12,5; 6,25; 3,125 và 0 μg/mL tương ứng 1%, 0,5%; 0,25%; 0,125%; 0,0625%; 0,03125% và 0%. DMSO trong môi trường nuôi cấy được sử dụng như một đối chứng âm và mơi trường ni cấy khơng có tế bào được sử dụng làm mẫu trắng. Tất cả các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần.
Các đĩa được ủ ở 37oC, CO2 5% và độ ẩm 95% trong 72 giờ. Sau đó, thêm vào mỗi giếng 10 μl MTT 5 mg/mL và ủ ở 37oC, CO2 5% trong 3,5 giờ. Thêm vào mỗi giếng 70 μl SDS 10% và ủ ở 37oC trong 16 giờ. Đo độ hấp thu của mỗi giếng bằng máy quang phổ quét Sunrise ở bước sóng 595 nm.
c. Tính kết quả
Giá trị CS: Tỷ lệ sống sót của tế bào được đo bằng tỷ lệ phần trăm độ hấp thụ so với đối chứng âm tính (DMSO).
CS (%) = !#" !$%&' x 100%
!! " !
$%&' Trong đó:
Ac: Giá trị độ hấp thu của mẫu chứng dương As: Giá trị độ hấp thu của mẫu thử
ADMSO: Giá trị độ hấp thu của mẫu chứng âm
Dựng đường biểu diễn giữa %CS và nồng độ mẫu thử để xác định chỉ số IC50.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN3.1. Xác định cấu trúc các hợp chất 3.1. Xác định cấu trúc các hợp chất
Như đã trình bày trong phần thực nghiệm (mục 2.3.1), bột cây N. aragoana (4 kg)