Cao chiết NA.Et NA.H NA.C NA.E Acarbose
Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các loại cao chiết thể hiện ở (Bảng 3.2) cho thấy: Giá trị IC50 của các loại cao thu được đều thấp hơn so với đối chứng acarbose 138,4 (µg/mL), chứng tỏ hoạt tính kháng enzyme α-glucosidase của các loại cao chiết này cao, và tăng dần theo thứ tự: Cao tổng chiết trong EtOH (NA.Et), cao n-hexane (NA.H), cao EtOAc (NA.E) và cao CHCl3 (NA.C) tương ứng 79,9; 37,6; 35,4 và 18,4 (µg/mL).
Từ kết quả xác định hoạt tính cho thấy các loại cao chiết đều khơng có hoạt tính gây độc tế bào MCF-7 và HepG2, nhưng hoạt tính ức chế α-glucosidase thể hiện mạnh ở cao NA.H, NA.E và NA.C. Tuy nhiên, kết quả TLC của cao NA.H, NA.C có các vết tương đồng, nhưng ở cao NA.H nhiễm béo nhiều, do đó, cao NA.C và NA.E được sử dụng để tiến hành phân lập.
Cao NA.C (25 g) tiến hành CC và TLC đã phân lập được 9 hợp chất, ký hiệu lần lượt là NA.03 (6,0 mg ), NA.04 (26,0 mg), NA.05 (12,0 mg), NA.06 (17,0 mg), NA.07 (12,0 mg), NA.08 (8,0 mg), NA.09 (15,0 mg), NA.10 (14,0 mg), NA.11 (10,0 mg).
Cao NA.E (90,0 g) tiến hành CC và TLC đã phân lập được 16 hợp chất, ký hiệu lần lượt là NA.01 (10,0 mg), NA.02 (14,0 mg), NA.12 (20,0 mg), NA.13 (8,0 mg), NA.14 (18,0 mg), NA.15 (32,0 mg), NA.16 (17,0 mg), NA.17 (11,0 mg), NA.18 (15,0 mg), NA.19 (10,0 mg), NA.20 (23,0 mg), NA.21 (14,0 mg), NA.22 (17,0 mg), NA.23 (8,0 mg), NA.24 (14,0 mg) và NA.25 (26,0 mg).
Sau đây là phần biện luận để xác định cấu trúc của các hợp chất trên.
3.1.1. Các hợp chất thuộc nhóm cycloartane
3.1.1.1. Hợp chất NA.01 (nerviside I, chất mới)
Hình 3.1. Cấu trúc hóa học và tương quan HMBC, NOESY của hợp chất NA.01 Hợp
chất NA.01 được phân lập từ cao NA.E (Sơ đồ 2.3), thu được dạng bột, màu trắng.
Phổ khối HR-ESI-MS (Phụ lục 1.1) của hợp chất NA.01 cho mũi ion phân tử giả [M-H]- tại m/z 651,4103 so với lý thuyết có m/z 651,4114; sai số 1,1 mmass, phù hợp công thức phân tử là C36H60O10.
Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δH ppm) (Phụ lục 1.2) của hợp chất NA.01
cho thấy ở vùng trường cao xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 1 cặp mũi đơi proton geminal ở δH 0,36 và δH 0,56 (1H; d; 4,0; H2-19) tương ứng với các proton methylene ở vị trí 19 của vòng cyclopropane của một cycloartane triterpene [60, 61]; 2 proton oxy methine ở δH 3,34 (1H, brs, H-1); 4,40 (1H; dd; 12,0; 4,5; H-3); 6 tín hiệu proton methyl ở δH 0,91 (3H, s, H-18), 0,82 (3H, s, H-21), 0,80-0,82 (3H; m; H-26, H-27), 0,97 (3H, s, H-29) và 0,89 (3H, s, H-30). Ngồi ra, xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng của proton anomer phân tử đường ở δH 4,14 (1H; d; 7,5; H-1'), các proton oxy methine và oxy methylene phân tử đường cộng hưởng trong vùng 2,88-3,66 ppm.
Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, δC ppm) (Phụ lục 1.3), phổ DEPT (Phụ lục
1.4) và phổ HSQC (Phụ lục 1.5) của hợp chất NA.01 cho 36 tín hiệu carbon, trong đó 31
tín hiệu có thể được gắn cho khung triterpenoid và 5 tín hiệu cịn lại thuộc về đơn vị monosaccharide. 31 tín hiệu carbon cộng hưởng của phần aglycone bao gồm 6 carbon methyl ở δC 18,0 (C-18), 18,3 (C-21), 17,1 (C-26, C-27), 9,5 (C-29) và 19,1 (C-30); 11 nguyên tử carbon methylene ở δC 36,1 (C-2), 22,0 (C-6), 25,1 (C-7), 25,0 (C-11), 32,6 (C- 12), 35,3 (C-15), 27,8 (C-16), 28,8 (C-19), 29,0 (C-22), 30,8 (C-23) và 64,7 (C-31) nối với oxy; 8 nguyên tử carbon methine ở δC 36,6 (C-5), 47,5 (C-8), 51,9 (C-17), 36,4 (C- 20), 32,3 (C-25), và 70,8 (C-1), 78,8 (C-3) mang oxy; và 7 carbon tứ cấp ở δC 53,0 (C-4), 21,1 (C-9), 28,9 (C-10), 44,8 (C-13), 48,7 (C-14) và 74,6 (C-24) nối với oxy (C-24) và 1 carbon carboxyl δC 178,5 (C-28). Tín hiệu cộng hưởng của đơn vị đường bao gồm δC
104,1 (C-1'); 73,7 (C-2'); 76,4 (C-3'); 69,6 (C-4') và 65,7 (C-5').
Phân tích kết hợp phổ HMBC (Phụ lục 1.6), COSY (Phụ lục 1.7) đã xác định được đầy đủ các tín hiệu 1H và 13C cho hợp chất NA.01 (Bảng 3.4).
Phân tích phổ hai chiều HMBC (Phụ lục 1.6) cho thấy trong vịng A, 1 nhóm methyl và 1 gốc carboxylic acid cùng nối vào vị trí δC 53,0 (C-4) dựa trên tương quan HMBC của cả proton oxy methine ở δH 4,40 (H-3) và methyl ở δH 0,97 (3H, s, H-29) với carbon ở δC 53,0 (C-4) và δC 178,5 (C-28), cũng như 3 proton ở δH 0,97 (3H, s, H-29) tương quan với carbon ở δC 78,8 (C-3). Ngoài ra, 1 nhóm hydroxyl được gắn ở vị trí δC
70,8 (C-1) dựa trên tương quan của các proton ở δH 0,36 và δH 0,56 (1H; d; 4,0; H-19), δH
4,40 (1H; dd; 12,0; 4,5; H-3) và δH 2,41 (1H; dd; 12,5; 4,0; H-5) đến vị trí δC 70,8 (C-1) và tương quan của proton δH 3,34 (1H, brs, H-1) đến carbon ở δC 36,1 (C-2), δC 78,8 (C-3) và δC 36,6 (C-5). Tín hiệu H-1 xen lẫn tín hiệu của nước cộng hưởng ở δH 3,34 ppm ở dạng mũi đơn rộng, cho thấy sự xuất hiện của nhóm α-hydroxyl [62].
Tín hiệu H-3 xuất hiện dưới dạng mũi đơi có hằng số ghép cặp Jaa = 12,0 Hz và Jae
=4,5 Hz xác định vị trí β-hydroxyl [63-65]. Độ dịch chuyển ở δC 78,8 (C-3) của aglycone chỉ ra rằng monosaccharide được liên kết tại vị trí này, điều này cịn được thấy ở tương quan HMBC của proton ở δH 4,14 (1H; d; 7,5; H-1') với δC 78,8 (C-3). Vùng δH 2,5-4,5 ppm
của phổ 1H-NMR xác nhận sự xuất hiện của 1 saccharide duy nhất, được xác định là β-xylose dựa trên tín hiệu mũi ba proton ở δH 2,97 (1H; t; 11,5; H-5') và δH 3,66 (1H; dd; 11,5;
5,0; H-5') [62]. Cấu hình β-xylopyranose được khẳng định dựa vào hằng số ghép lớn của proton anomer của H-1' (J = 7,5 Hz).
Phổ HMBC cho thấy mối tương quan giữa proton oxy methylene cộng hưởng ở δH
3,25 (2H, m, H-31) với δC 30,8 (C-23), δC 74,6 (C-24) và δC 32,3 (C-25) xác định sự xuất hiện của nhóm hydroxy methyl ở C-24, giống với chuỗi của các chất nerviside đã được báo cáo trước đây [66, 67].
Phổ COSY (Phụ lục 1.7) của hợp chất NA.01 cho thấy mối tương quan của tất cả các proton trong vịng xylopyranose, về độ dịch chuyển hóa học cũng như các giá trị hằng số ghép cặp hoàn toàn phù hợp với các giá trị J được báo cáo trước đây đối với gốc đường
β-D-xylopyranose [68-70].
Phổ NOESY (Phụ lục 1.8) của hợp chất NA.01 cho thấy các tương quan giữa các proton ở δH 3,34 (1H, brs, H-1), δH 0,36 và δH 0,56 (1H; d; 4,0; H-19), và δH 0,97 (3H, s, H-29) xác định hướng β của chúng, do đó vị trí α của nhóm 4-COOH cũng được xác định. Hóa học lập thể của các vịng A/B/C/D [71] được cung cấp bởi dữ liệu 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất NA.01 gần giống với các cycloartane triterpene [72], nerviside A- C [19], nerviside D-H [22], và chuỗi cyclopassifloic acid [73], và được hỗ trợ bởi các mối tương quan NOESY. Phổ của các carbon mạch nhánh hầu như không ảnh hưởng đến hệ thống các vòng của dẫn xuất triterpene [74]. Hơn nữa, mạch nhánh không nhạy cảm với những thay đổi cấu trúc từ carbon bất đối [75], nên chúng có thể được sử dụng để xác định cấu hình tuyệt đối của C-24 trong một số sterol. Vì vậy, để xác định cấu hình tuyệt đối ở C-24, các phép tính độ dịch chuyển hóa học 13C-NMR của mơ hình đơn giản chỉ bao gồm hai vịng C và D, được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp cấu trúc điện tử trên các cấu trạng có năng lượng thấp nhất trong cả hai đồng phân epimer C-24 được xác định nhanh chóng bằng cách quét bề mặt năng lượng với tọa độ ban đầu có sẵn trong các CIF tinh thể học tia X liên quan đến các dẫn xuất của cycloartane [76-78]. So sánh dữ liệu 13C-NMR mơ phỏng của hai epimer có thể có với dữ liệu phổ thực tế dẫn đến dự đốn cấu hình 24R với độ tin cậy là 99,2% (Bảng 3.3).
Bảng 3.3. Kết quả tính tốn DFT cho hai epimer 24R và 24S của hợp chất NA.01
Vị trí C-24
Nerviside D Nerviside C Hình 3.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất nerviside C, D
Từ những dữ liệu trên và so sánh với tài liệu [22] (Bảng 3.4) và (Hình 3.2), hợp chất NA.01 là 3β-O-D-xylopyranosyl-1a,24R,31-trihydroxylcycloartan-28-oic acid. Kiểm tra trên Scifinder ngày 17/04/2019 tại trường Đại học Chulalongkorn Thái Lan cho kết quả chất mới, được đặt tên là nerviside I (Hình 3.1).
Bảng 3.4. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất NA.01
Vị Hợp chất trí 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Nerviside D (C5D5N) [22] δH (J, Hz) 3,88 (1H, brs) 2,25-2,31 (1H, m); 2,75-2,80 (1H, m) 5,50 (1H; dd; 12,1; 4,3) 3,40 (1H; dd; 10,8; 3,2) 1,20*; 1,75* 1,24*; 1,40* 1,53* 1,39*; 2,67-2,72 (1H, m) 1,55*; 1,67* 1,14-1,20 (1H, m); 1,28*
18 0,36 (1H; 19 0,56 (1H; 20 21 22 23 24 25 26 0,80-0,82 (3H, 27 0,80-0,82 (3H, 28 29 30 31 1' 4,14 (1H; 2,88 (1H; 2' 3' 3,05 (1H; 4' 3,66 (1H; 5' 2,97 (1H; * overlapped signals
3.1.1.2. Hợp chất NA.02 (nerviside J, chất mới)
Hợp chất NA.02 được phân lập từ cao NA.E (Sơ đồ 2.3), dạng chất rắn vơ định
hình, màu trắng.
Phổ khối HR-ESI-MS (Phụ lục 2.1) của hợp chất NA.02 cho mũi ion phân tử giả [M-H]- tại m/z 693,4215 so với lý thuyết có m/z 693,4219; sai số 0,4 mmass, phù hợp công thức phân tử là C38H62O11. Điều này gợi ý rằng NA.02 khác với NA.01 là có thêm nhóm acetyl.
Theo đó, cả dữ liệu phổ 1H-NMR (Phụ lục 2.2) và 13C-NMR (Phụ lục 2.3) và DEPT (Phụ lục 2.4) rất giống nhau giữa hai hợp chất, nhưng phổ 1H-NMR của NA.02
cho thấy 1 nhóm methyl nữa cộng hưởng ở δH 1,99 (3H, s), bên cạnh đó phổ 13C-NMR thể hiện thêm 1 carbon carbonyl ở δC 170,3 và carbon methyl ở δC 20,7.
Phân tích kết hợp phổ HSQC (Phụ lục 2.5), HMBC (Phụ lục 2.6), COSY (Phụ lục
2.7) và NOESY (Phụ lục 2.8) xác định được đầy đủ các tín hiệu 1H và 13C và các tương quan trên cấu trúc phân tử hợp chất NA.02.
Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất NA.02
V ị trí 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Hợp chất NA.02 (DMSO-d6) Nerviside C
(C5D5N) [19] δH (J, Hz) 3,86 (1H, brs) 2,28 (1H, m); 2,76 (1H, m) 5,49 (1H; dd; 12,0; 4,4) 3,39 (1H; dd; 12.0; 4,1) 1,22*; 1,75* 1,24*; 1,38* 1,55 (1H, m) 1,40 (1H, m); 2,69 (1H, m) 1,50*; 1,67* 1,18*; 1,33*
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 1' 2' 3' 4' 5' OAc * overlapped signals
Phổ hai chiều HMBC thể hiện mối tương quan của khung cycloartane glycoside tương tự như trong hợp chất NA.01, ngoại trừ sự acetyl hóa của nhóm hydroxyl ở C-31 do có sự tương quan HMBC từ proton methyl ở δH 1,99 đến carbon carbonyl ở δC 170,3 (C- 32), cũng như từ proton δH 3,89 và 3,85 (2H; d; 11,0; H-31) đến δC 170,3 (C-32), điều này cho thấy có sự xuất hiện của 1 nhóm acetyl trong cấu trúc của NA.02. Ngồi ra, cấu hình C-24R hồn tồn tương tự với hợp chất NA.01 dựa trên sự giống nhau giữa các tín hiệu
Từ những dữ liệu trên và so sánh với tài liệu [19] (Bảng 3.5) và (Hình 3.2), hợp chất NA.02 là 3β-O-D-xylopyranosyl-31-O-acetyl-1α,24R-dihydroxycycloartan-28-oic acid. Kiểm tra trên Scifinder ngày 17/04/2019 tại trường Đại học Chulalongkorn Thái Lan cho kết quả chất mới, được đặt tên là nerviside J (Hình 3.3).
3.1.2. Hợp chất thuộc nhóm benzofuran - Hợp chất NA.03 (nervione, chất mới)
Hình 3.4. Cấu trúc hóa học và tương quan HMBC, NOESY của hợp chất NA.03 Hợp
chất NA.03 được phân lập từ cao NA.C (Sơ đồ 2.2), dạng bột vơ định hình, màu trắng.
Phổ khối HR-ESI-MS (Phụ lục 3.1) của hợp chất NA.03 xuất hiện mũi ion phân tử giả [M+Na]+ ở m/z 271,0576 so với lý thuyết có m/z 271,0582; sai số 0,6 mmass, phù hợp công thức phân tử là C13H12O5.
Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δH ppm) (Phụ lục 3.2) của hợp chất NA.03
xác định 3 proton methine thơm tại δH 8,07 (1H; d; 2,5; H-11), 7,45 (1H; t; 0,5; H-4) và 7,37 (1H; dd; 1,0; 2,5; H-10); 2 proton oxy methine δH 5,33 (1H; dd; 1,0; 4,5; H-3) và 3,96 (1H, m, H-8); 1 nhóm hydroxyl δH 5,24 (1H; d; 5,5; 8-OH); 1 mũi đơn methoxyl δH
4,25 (3H, s, 7-OCH3), và 1 nhóm methyl δH 1,06 (3H; d; 6,5; H-9).
Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, δC ppm) (Phụ lục 3.3) và phổ HSQC (Phụ
lục 3.4) của hợp chất NA.03 cho 13 tín hiệu carbon, trong đó có 1 carbon carbonyl ester ở δC 167,4 (C-1); 3 carbon methine vòng thơm δC 145,9 (C-11), 105,9 (C-10), 99,8 (C-4); 2 carbon oxy methine tại δC 82,4 (C-3), 67,9 (C-8); 1 carbon methoxyl δC 60,2 (12-OCH3); 1 carbon methyl δC 17,9 (C-9); và 5 carbon tứ cấp δC 160,0 (C-5), 152,6 (C-7), 145,7 (C- 3a), 117,6 (C-6), 108,9 (C-7a).
Phổ HMBC (Phụ lục 3.5) cho thấy trong vòng A, methyl ở δH 1,06 (3H; d; 6,5; H- 9)tương quan đến δC 82,4 (C-3) và 67,9 (C-8); proton ở δH 3,96 (1H, m, H-8) tương quan với
δC 82,4 (C-3), và proton δH 5,33 (1H; dd; 1,0; 4,5; H-3) với δC 67,9 (C-8) và 17,9 (C-9)
xác định kết nối thông qua C-3-C-8-C-9. Hơn nữa, tương quan HMBC của nhóm hydroxyl δH 5,24 (1H; d; 5,5; 8-OH) với δC 82,4 (C-3), 67,9 (C-8) và 17,9 (C-9) cho thấy vị trí của nhóm này. Sự lactone hóa giữa δC 82,4 (C-3) và 167,4 (C-1) được xác định bằng tương quan HMBC của δH 5,33 (1H; dd; 1,0; 4,5; H-3) với δC 167,4 (C-1). Cuối cùng, kết nối giữa các vịng A và B được xác định tại C-3a thơng qua tương quan HMBC của cả 2 proton δH 5,33 (1H; dd; 1,0; 4,5; H-3) và 3,96 (1H, m, H-8) với δC 145,7 (C-3a). Ngồi ra, nhóm methoxyl được nối vào C-7 do có sự tương quan nhóm -OCH3 ở δH 4,25 (3H, s) với carbon δC 152,6 (C-7).
Trong vòng C, 2 proton δH 7,37 (1H; dd; 1,0; 2,5; H-10) và 8,07 (1H; d; 2,5; H-11) ghép đôi với nhau với giá trị J = 2,5 Hz. Phân tích giá trị J nhỏ này và sự dịch chuyển hóa học trường thấp của H-11 cho thấy sự hiện diện của 1 vòng furan [79-81]. Vòng furan này được hợp nhất với vòng B ở δC 160,0 (C-5) và 117,6 (C-6) dựa trên mối tương quan HMBC của cả δH 7,37 (1H; dd; 1,0; 2,5; H-10) và 8,07 (1H; d; 2,5; H-11) với δC 160,0 (C- 5) và 117,6 (C-6). Như vậy, 4 cấu trúc có thể có của NA.03 là (I), (II), (III) và (IV) (Hình
3.5). Đồng phân phù hợp được xác định là (I) do có sự tương quan 4J HMBC giữa δH 5,33 (1H; dd; 1,0; 4,5; H-3) với δC 160,0 (C-5).
Hình 3.5. Bốn đồng phân cấu tạo của NA.03
Phổ NOESY (Phụ lục 3.6) cho thấy proton tại δH 7,45 (1H; t; 0,5; H-4) cho tương quan NOESY của δH 5,33 (1H; dd; 1,0; 4,5; H-3) và 3,96 (1H, m, H-8) với δH 7,45 (1H; t; 0,5; H-4) và giữa δH 4,25 (3H, s, 7-OCH3) và δH 7,37 (1H; dd; 1,0; 2,5; H-10).
Hình 3.6. Sinh tổng hợp nervione từ coriandrone E
Dữ liệu NMR của NA.03 giống với dữ liệu của coriandrone E [79], ngoại trừ
những thay đổi cấu trúc trong vịng A. Theo đó, cấu trúc hóa học của NA.03 đã được làm sáng tỏ, đó là nervione. Sự giống nhau về cấu trúc giữa coriandrone E và nervione là do sự hình thành nervione được sinh tổng hợp từ coriandrone E qua q trình ester hóa cấu hình trans (Hình 3.6) [79]. Nervione đại diện cho khung benzo[1,2-b:4,5-c′]difuran- 5(7H)-one đầu tiên trong tự nhiên.
Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Vị trí Hợp chất NA.03 (DMSO -d δH (J, Hz) 167,4 82,4 145,7 99,8 160,0 117,6 152,6 108,9 67,9 17,9 105,9 145,9 60,2
Hai tâm bất đối của NA.03 dẫn đến 4 đồng phân quang học có thể có là (Ia), (Ib), (Ic) và (Id) tương ứng với cấu hình (R-S), (S-S), (R-R) và (S-R) (Hình 3.7). Phân tích phổ NOESY và so sánh các hằng số ghép cặp J của cả đồng phân syn và anti của các hợp chất tương tự, không đưa ra được kết luận nào liên quan đến hóa học lập thể của NA.03. Cả đồng phân syn và anti đều có các giá trị JH-3/H-8 tương tự nhau [82]. Để xác định cấu hình của NA.03, các tính tốn chuyển dịch hóa học DFT-NMR và phương pháp xác suất DP4+ được thực hiện để xác định cấu hình phù hợp [83-87].
Hình 3.7. Bốn đồng phân quang học của NA.03
Hình 3.8. Phổ ECD của NA.03
Bảng 3.7. Kết quả DP4+ cho các đồng phân isomer 1 (S-R) và isomer 1 (S-S)
Cấu hình tuyệt đối của trung tâm lập thể C-3, C-8 được ấn định bằng cách so sánh phổ ECD của NA.03 với phổ của các hợp chất được báo cáo trước đây. Đặc biệt, phổ
ECD của NA.03 cho thấy hiệu ứng cotton mạnh ở khoảng 216 nm (De+1,2) (Hình 3.8). Hiệu ứng cotton này tương tự như hiệu ứng cotton của spirolaxine [88], pestaphthalides A [89], hoặc virgatulolide A-B [90], cho thấy rằng chúng có cùng cấu hình (3S). Kết quả DP4+ giúp xác định đồng phân lập thể (Id) (Hình 3.7) có cấu hình (3S, 8R) được xác định với xác suất 100% (Bảng 3.7). Như vậy, cấu hình tuyệt đối của NA.03 xác định là 3S, 8R.
Từ các dữ liệu phổ đã phân tích như trên và so sánh dữ liệu phổ đo trong DMSO-
d6 và trong CD3OD (Bảng 3.6), hợp chất NA.03 là nervione (Hình 3.4). Kiểm tra trên
Scifinder ngày 10/02/2021 tại trường Đại học Chulalongkorn Thái Lan cho kết quả chất mới, là hợp chất lần đầu tiên được cơng bố.
3.1.3. Các hợp chất thuộc nhóm flavone
3.1.3.1. Hợp chất NA.04 (5,7-dimethoxyflavone)
Hình 3.9. Cấu trúc hóa học và tương quan HMBC của hợp chất NA.04
Hợp chất NA.04 được phân lập từ cao NA.C (Sơ đồ 2.2), dạng bột vơ định hình, màu trắng ngà.
Phổ 1
H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δH ppm) (Phụ lục 4.1) của hợp chất NA.04
cho 2 tín hiệu mũi đơi tại δH 6,41 (1H; d; 2,5; H-6) và 6,73 (1H; d; 2,5; H-8) cho thấy đây là 2 proton methine trên nhân thơm ghép cặp meta, và 1 mũi đơn tại δH 6,69 (1H, s, H-3), cho thấy proton này khơng ghép spin với proton nào. Bên cạnh đó, cịn có 2 proton methine vịng thơm ghép cặp ortho có cường độ gấp đơi so với các proton khác ở δH 7,96 (2H; dd; 1,5; 7,5; H-2', H-6'), và 3 proton methine cộng hưởng ở δH 7,50 (3H; m; H-3', H- 4', H-5') chứng tỏ hợp chất NA.04 là một flavone có vịng A mang 2 nhóm thế và vịng B có cấu trúc đối xứng khơng gắn với nhóm thế nào. Ngồi ra, cịn có sự hiện diện của 6 proton của 2 nhóm methoxyl ở δH 3,79 (3H, s, 5-OCH3) và δH 3,85 (3H, s, 7-OCH3).
Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, δC ppm) (Phụ lục 4.2) của hợp chất NA.04 cho 17 tín hiệu carbon, trong đó có 1 carbon carbonyl ở δC 175,5 (C-4), 4 carbon tứ cấp của vòng thơm mang oxy ở δC 159,4 (C-2), 160,2 (C-5), 163,6 (C-7) và 159,1 (C-9); 2 carbon tứ cấp của vịng thơm khơng mang oxy ở δC 108,3 (C-10) và 131,2 (C-1'); 8 carbon methine vòng thơm ở δC 108,1 (C-3), 96,1 (C-6), 93,2 (C-8), 125,7 (C-2', C-6'), 128,8 (C-3', C-5') và 130,8 (C-4'). Ngồi ra, cịn có 2 carbon methoxyl ở δC 55,8 (5-OCH3) và 55,9 (7-OCH3). Các dữ liệu trên giúp xác định NA.04 là dẫn xuất của flavone mang 2 nhóm thế methoxyl.
Phổ HSQC (Phụ lục 4.3) cho thấy 2 carbon methyl ở δC 55,8 (5-OCH3) và 55,9 (7- OCH3) tương quan tương ứng với 6 proton 2 nhóm methoxyl ở δH 3,79 (3H, s, 5-OCH3) và 3,85 (3H, s, 7-OCH3).
Phổ HMBC (Phụ lục 4.4) cho thấy 6 tín hiệu proton của 2 nhóm methoxyl ở δH
3,79 (3H, s, 5-OCH3) và 3,85 (3H, s, 7-OCH3) tương quan với carbon tứ cấp của vòng thơm mang oxy ở δC 160,2 (C-5) và 163,6 (C-7) xác nhận nhóm methoxyl δC 55,8 (5-