Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất tinh khiết được trình bày trong mục 2.3.3.1. Thử nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Hóa dược, khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả thử nghiệm thu được thể hiện ở (Bảng 3.30).
Bảng 3.30. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các chất tinh khiết Thứ tự chất NA.03 NA.04 NA.05 NA.06 NA.07 NA.08 NA.10 NA.11 NA.12 NA.13 NA.14 NA.15 NA.16 NA.18 NA.20 NA.21 NA.22 NA.23 NA.25
Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của 19 hợp chất tinh khiết thu được thể hiện ở(Bảng 3.30) cho thấy: Giá trị IC50 của các hợp chất NA.03, NA.04, NA.05, NA.06, NA.07, NA.08, NA.10, NA.11, NA.16 và NA.23 lớn hơn 250 µM, và cao hơn so với đối chứng acarbose 214,5 µM, các hợp chất còn lại đều thấp hơn. Trong đó, khả năng kháng enzyme α- glucosidase theo thứ tự từ cao nhất đến thấp: NA.25, NA.18, NA.20, NA.22, NA.15, NA.12, NA.13, NA.21, NA.14 tương ứng 1,4; 31,6; 35,6; 36,9; 42,0; 62,8; 68,3; 86,6; 97,7 µM. Trong số các hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase, hợp chất có khả năng ức chế mạnh nhất là NA.25 cao gấp 153,2 lần so với đối chứng acarbose, kết quả này thấp hơn so với nghiên cứu về hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của caffeic acid trong điều trị đái tháo đường type 2 với IC50 0,90 µM [114]. Các hợp chất NA.18, NA.20, NA.22, NA.15 cao gấp 5,1-6,8 lần; các hợp chất NA.12, NA.13, NA.21, NA.14 cao gấp 2,2-3.4 lần so với đối chứng acarbose. Trong đó, hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của isoquercitrin có IC50
36,9 µM thấp hơn so với kết quả nghiên cứu [115] (24,0 µM).
Tiềm năng ức chế α-glucosidase của flavonoid đã được nghiên cứu và báo cáo rộng rãi, dựa vào mối quan hệ hoạt động của các nhóm thế trên cấu trúc của nhóm hợp chất này (Hình 3.31). Các nghiên cứu cho thấy, nhóm thế hydroxyl vào vị trí C-3, C-5 và C-4' làmtăng khả năng ức chế α-glucosidase, ngược lại nếu nhóm thế ở vị trí C-3, C-7 là nhóm methyl hoặc đường đều làm giảm tác dụng ức chế. Tất cả các bài báo đều cho rằng nhóm hydroxyl tự do ở C-4', có thể tạo ra các tương tác chính với enzyme, được coi là rất quan trọng. Đặc biệt các nghiên cứu đối với α-glucosidase của S. cerevisiae, cho thấy các nhóm hydroxyl ở vị trí C-3 và C-7, oxy carbonyl ở vị trí C-4 và các nhóm hydroxyl của vòng B là một trong những nhóm chính làm tăng cường liên kết thông qua liên kết H [116, 117].
Hình 3.31. Ảnh hưởng của các nhóm thế flavonoid lên hoạt tính ức chế α-glucosidase Từ các biện luận trên so với kết quả nghiên cứu hoạt tính ức chế α-glucosidase của các 8 hợp chất thuộc nhóm flavonol NA.18, NA.20, NA.22, NA.15, NA.12, NA.13, NA.21, NA.14 (Bảng 3.30) cho thấy chúng đều có nhóm hydroxyl ở vị trí C-5 và C-4' tự do, và TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com
nhóm oxy carbonyl ở vị trí C-4; các vị trí C-3, C-7 và C-3' gắn với các nhóm thế khác nhau như hydroxyl, methoxy, O-glycoside tạo ra sự khác nhau về mức độ ức chế α- glucosidase của các hợp chất này.
3.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào
Phương pháp thử hoạt tính gây độc các dòng tế bào khối u MCF-7 và K562 của các chất tinh khiết NA.01 và NA.02 được trình bày trong mục 2.3.3.2. Thử nghiệm được tiến hành tại Phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử, Bộ môn Di truyền, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành. Kết quả thử nghiệm thu được như sau:
Bảng 3.31. Hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất NA.01 và NA.02 Dòng tế bào
K562
MCF-7
Kết quả thử nghiệm cho thấy cả hai hợp chất NA.01 và NA.02 đều có hoạt tính trung bình chống lại hai dòng tế bào ung thư này. Theo kết quả từ tài liệu [19, 22] các hợp chất nerviside A-H đều không có hoạt tính gây độc tế bào HepG2 kết hợp với kết quả thử hoạt tính của các loại cao chiết (Bảng 3.2), do đó không thử nghiệm hoạt tính gây độc trên dòng tế bào HepG2 này.
Nhận xét chung về hoạt tính sinh học, hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase được xác định trên cao tổng, các cao phân đoạn và 19 hợp chất tinh khiết. Trong đó, 2 loại cao NA.C và NA.E được sử dụng để phân lập các hợp chất có IC50 tương ứng là 18,4; 35,4 (µg/mL). Các hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase thuộc nhóm flavonol và caffeic acid, trong đó, các flavonol có hoạt tính ức chế mạnh gấp 2,2-6,8 lần; còn caffeic acid có hoạt tính mạnh nhất cao gấp 153,2 lần so với đối chứng acarbose. Hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất nerviside I và nerviside J có hoạt tính ức chế trung bình trên hai dòng tế bào K562 và MCF-7.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
Cây N. aragoana được thu hái tại huyện Cư M’gar, tỉnh Đắk Lắk. Từ bột toàn cây
N. aragoana (4 kg), ngâm chiết trong dung môi EtOH 96% thu được cao tổng EtOH - NA.Et (280,0 g). Chiết phân đoạn bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng thu được các cao phân đoạn bao gồm cao n-hexane - NA.H (110,0 g), cao CHCl3 - NA.C (25,0 g), cao EtOAc - NA.E (90,0 g) và cao nước - NA.W (45,0 g).
Từ cao NA.C (25 g) tiến hành CC và TLC đã phân lập được 9 hợp chất, ký hiệu lần lượt là NA.03 (6,0 mg ), NA.04 (26,0 mg), NA.05 (12,0 mg), NA.06 (17,0 mg), NA.07 (12,0 mg), NA.08 (8,0 mg), NA.09 (15,0 mg), NA.10 (14,0 mg), NA.11 (10,0 mg).
Từ cao NA.E (90,0 g) tiến hành CC và TLC đã phân lập được 16 hợp chất, ký hiệu lần lượt là NA.01 (10,0 mg), NA.02 (14,0 mg), NA.12 (20,0 mg), NA.13 (8,0 mg), NA.14 (18,0 mg), NA.15 (32,0 mg), NA.16 (17,0 mg), NA.17 (11,0 mg), NA.18 (15,0 mg), NA.19 (10,0 mg), NA.20 (23,0 mg), NA.21 (14,0 mg), NA.22 (17,0 mg), NA.23 (8,0 mg), NA.24 (14,0 mg) và NA.25 (26,0 mg).
Cấu trúc của các hợp chất này được xác định dựa vào số liệu phổ ESI-MS, phổ 1D NMR (1H-NMR và 13C-NMR) và 2D NMR (HSQC, HMBC, COSY), cấu hình tuyệt đối của hợp chất được xác định dựa vào phương pháp DP4+, ECD; đồng thời đối chiếu với các tài liệu tham khảo, đã xác định được cấu trúc hóa học của 25 hợp chất.
Trong 25 hợp chất thu được có nerviside I (NA.01), nerviside J (NA.02), nervione (NA.03) là 3 hợp chất lần đầu tiên được phân lập và công bố trên thế giới. Trong 22 hợp chất còn lại có 14 hợp chất bao gồm 7 hợp chất thuộc nhóm flavone đó là 5,7-dimethoxyflavone (NA.04), 4'-hydroxy-5,7-dimethoxyflavone (NA.05), 3,5,7-trimethoxyflavone (NA.06), tetramethylscutellarein (NA.07), 5-hydroxy-7-methoxyflavone (NA.08), 5-hydroxy-3,7- dimethoxyflavone (NA.09), 5,7-dihydroxy-3',4'-dimethoxyflavone (NA.10); 4 hợp chất thuộc nhóm flavonol bao gồm kaempferol (NA.19), astragalin (NA.20), kaempferol-3-O-β-D- xylopyranoside (NA.21), isoquercitrin (NA.22);
1hợp chất thuộc nhóm isoflavone là genistin (NA.23); và 2 acid là gallic acid (NA.24) và caffeic acid (NA.25) là các hợp chất lần đầu tiên phân lập được ở chi Nervilia. Các hợp
chất còn lại thuộc nhóm flavonol bao gồm rhamnetin (NA.11), rhamnocitrin (NA.12), nervilifordin B (NA.13), complanatuside (NA.14), rhamnazin (NA.15), flavoyadorinin A (NA.16), nervilifordizin B (NA.17), nervilifordizin B (NA.18), 8 hợp chất này lần đầu tiên được tìm thấy ở loài N. aragoana.
Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của cao tổng NA.Et, các cao phân đoạn NA.H, NA.C, và NA.E có IC50 tương ứng là 79,9; 37,6; 18,4; 35,4 (µg/mL). Xác định được hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của 19 hợp chất tinh khiết, trong đó nervione (NA.03); các hợp chất thuộc nhóm flavone 5,7-dimethoxyflavone (NA.04), 4'-hydroxy-5,7-
dimethoxyflavone (NA.05), 3,5,7-trimethoxyflavone (NA.06), 4',5,6,7- tetramethoxyflavone (NA.07), 5-hydroxy-7-methoxyflavone (NA.08), 5,7-dihydroxy- 3',4'-dimethoxyflavone (NA.10); isoflavone genistin (NA.23); và 2 flavonol rhamnetin (NA.11), flavoyadorinin A (NA.16) đều có IC50 >250 µM so với đối chứng acarbose 214,5 µM cho thấy các hợp chất này có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase thấp. Các hợp chất còn lại đều có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase cao hơn so với đối chứng theo thứ tự từ cao nhất đến thấp: caffeic acid (NA.25), nervilifordizin A (NA.18), astragalin (NA.20), isoquercitrin (NA.22), rhamnazin (NA.15), rhamnocitrin (NA.12), nervilifordin B (NA.13), kaempferol-3-O-β-D-xylopyranoside (NA.21), complanatuside (NA.14) có IC50 tương ứng là 1,4; 31,6; 35,6; 36,9; 42,0; 62,8; 68,3; 86,6; 97,7 (µM).
Hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất nerviside I (NA.01) và nerviside J (NA.02) có IC50 tương ứng 13,3; 14,3 (µM) ở dòng tế bào K562, và 26,1; 62,7 (µM) đối với dòng tế bào khối u MCF-7.
Tổng lược về kết quả nghiên cứu của luận án:
Cây N. aragoana được thu tại huyện Cư M’gar, tỉnh Đắk Lắk đã phân lập và xác định cấu trúc của 25 hợp chất, trong đó có 3 hợp chất: nerviside I, nerviside J, nervione là 3 hợp chất lần đầu tiên được phân lập và công bố trên thế giới. 14 hợp chất bao gồm 7 hợp chất thuộc nhóm flavone, 4 hợp chất thuộc nhóm flavonol, 1 hợp chất thuộc nhóm isoflavone và 2 acid (gallic acid và caffeic acid) là các hợp chất lần đầu tiên phân lập được
ở chi Nervilia. Các hợp chất còn lại thuộc nhóm flavonol lần đầu tiên được tìm thấy ở loài
Caffeic acid và các flavonol thu được thể hiện hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase cao hơn so với đối chứng acarbose đó là nervilifordizin A, astragalin, isoquercitrin, rhamnazin, rhamnocitrin, nervilifordin B, kaempferol-3-O-β-D- xylopyranoside, complanatuside. Trong đó, caffeic acid là hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase mạnh nhất cao gấp 153,2 lần so với đối chứng acarbose, các hợp chất còn lại có hoạt tính cao gấp 2,2-6,8 lần so với đối chứng acarbose.
Kết quả này là những đóng góp mới ở Việt Nam cũng như trên thế giới và là những đóng góp có giá trị cho kho tàng nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên, đồng thời góp phần vào danh sách các dược liệu có tiềm năng trong điều trị đái tháo đường type 2.
4.2. Kiến nghị
Tiếp tục khảo sát phân đoạn cao n-hexane NA.H, cao nước NA.W và các phân đoạn còn lại của các cao NA.C và NA.E.
Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các chất chưa xác định NA.01, NA.02, NA.09, NA.17, NA.19, NA.24. Thử hoạt tính sinh học khác như khả năng kháng oxy hóa, kháng đái tháo đường in vivo, kháng viêm… của các hợp chất phân lập được.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. P.H. Hộ, Cây Cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, 1999.
[2]. Đ.H. Bích, Đ.Q. Chung, et al., Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam (tập 1), NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2003.
[3]. W. Zhengyi, P. H. Raven, and H. Deyuan, Flora of China, Science Press (Beijing) & Missouri Botanical Garden (St. Louis), 2009, 25, 197–201. [4]. www.theplantlist.org. Nervilia concolor Available from:
http://www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-135271.
[5]. L. V. Averyanov, Nervilia gracilis – A New Orchid Species from Northern Vietnam, Taiwania, 2011, 56 (1), 50-53.
[6]. R. Yonzone, D. Lama, et al., Diversity, Distribution and Present Status of Nervilia Commerson ex Gaudichaud (Orchidaceae) in Darjeeling Himalaya, West Bengal, India, East Himalayan Society for Spermatophyte Taxonomy, 2013, 7 (1),
146-154. [7]. L.V. Averyanov, The orchids of Vietnam. Illustrated survey. Part 3. Subfamily Epidendroideae (primitive tribes – Neottieae, Vanilleae, Gastrodieae, Nervilieae), Turczaninowia, 2011, 14, 15-100.
[8]. Đ.T. Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Thời Đại - Hà Nội,
2011.
[9]. M.M. Hossain, Therapeutic orchids: traditional uses and recent advances — An overview, Fitoterapia, 2011, 82 (2), 102-140.
[10]. N. Tập, Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam, Viện Dược Liệu, Khoa Tài nguyen Dược liệu, Hà Nội, 2004.
[11]. C. Wiart, Medicinal Plants of China, Korea, and Japan: Bioresources for Tomorrow’s Drugs and Cosmetics, CRC Press, 2012, 120-121.
[12]. O. Blackswan, Indian Medicinal Plants: A Compendium of 500 Species, Orient Longman, 1995, 4, 131-133.
[13]. H.S. Zhen, Y.Y. Zhou, et al., Studies on the chemical constituents of the ethyl acetate portion of Nervilia fordii, Zhong Yao Cai, 2007, 30 (8), 942-945. [14]. G.X. Zhou, C.L. Lu, et al., An acetyl flavonol from Nervilia fordii (Hance) Schltr, Journal of Asian Natural Products Research, 2009, 11 (6), 498-502.
[15]. L.-W. Tian, Y. Pei, et al., 7-O-Methylkaempferol and -quercetin Glycosides from the Whole Plant of NerWilia fordii, Journal of Natural Products, 2009, 72, 1057–1060. [16]. H.S. Zhen, Q. Qiu, et al., Studies on the chemical constituents of the petroleum ether portion of Nervilia fordii, Zhong Yao Cai, 2010, 33 (5), 717-719. [17]. L. Zhang, C.C. Zhu, et al., Simultaneous determination of seven flavonoids in Nervilia fordii with HPLC, Yao Xue Xue Bao, 2011, 46 (10), 1237- 1240.
[18]. L. Zhang, Z.-X. Zhao, et al., Three new flavonol glycosides from Nervilia fordii, Phytochemistry Letters, 2012, 5 (1), 104-107.
[19]. L.B. Wei, J.M. Chen, et al., Three new cycloartane glycosides from Nervilia fordii, Journal of Asian Natural Products Research, 2012, 14 (6), 521-527. [20]. J.M. Chen, L.B. Wei, et al., A flavonoid 8-C-glycoside and a
triterpenoid cinnamate from Nervilia fordii, Journal of Asian Natural Products Research, 2013, 15 (10),1088-1093.
[21]. L. Qiu, Y. Jiao, et al., Five new flavonoid glycosides from Nervilia fordii, Journal of Asian Natural Products Research, 2013, 15 (6), 589-599.
[22]. L.-B. Wei, H.-E. Yuan, et al., Five New Cycloartane-Type Triterpenoid Saponins from Nervilia fordii, Helvetica Chimica Acta, 2013, 96 (1), 150-157. [23]. H. Gui-kun, Q. Li, et al., A new labdane diterpenoid glycoside from Nervilia fordii, Acta Pharmaceutica Sinica, 2014, 49 (5), 652−655.
[24]. Q. Wei, J.Z. Xie, et al., Two new flavonoid glycosides from Nervilia fordii, Yao Xue Xue Bao, 2016, 51 (6), 961-964.
[25]. N. Ikekaw, Y. Fujimoto, et al., Effective separation of sterol C-24 epimers, Journal of Chromatography, 1989, 468, 91-98.
[26]. E. Thomas, T. Aneesh, et al., GC-MS analysis of phytochemical compounds present in the rhizomes of Nervilia aragoana Gaud., 2013, 6 (3). [27]. E. Thomas, T.P. Aneesh, and D.G. Thomas, Nervilia aragoava Gaud, a terrestrial orchid Indo-Global Research Journal of Pharmaceutical Sciences, 2013, 3 (3).
[28]. H.S. Zhen, Y.Y. Zhou, et al., Study on anticancer effect in vivo of active fraction from Nervilia fordii, Zhong Yao Cai, 2007, 30 (9), 1095-1098.
[29]. Y.J. Xu, Y.B. Chen, and L.L. Wang, Effect of Nervilla fordii on lung aquaporin 1 and 5 expression in endotoxin-induced acute lung injury rat, Zhongguo Zhong Xi Yi JieHe Za Zhi, 2010, 30 (8), 861-866.
[30]. H. Ming-qing, X. You-liang, et al., Protection of Total Flavonoid Fraction from Nervilia fordii on Lipopolysaccharide-induced Acute Lung Injury in Rats, Chinese Herbal Medicines, 2012, 4 (4), 287-293.
[31]. T. Lin, W. Luo, et al., Rhamnocitrin extracted from Nervilia fordii inhibited vascular endothelial activation via miR-185/STIM-1/SOCE/NFATc3, Phytomedicine, 2020,79, 153350.
[32]. Y. Yao, Y. Yuan, et al., Effects of Nervilia fordii Extract on Pulmonary Fibrosis Through TGF-β/Smad Signaling Pathway, Front Pharmacol, 2021, 12, 659627.
[33]. K.H. Reddy, P.V. Sharma, and O.V. Reddy, A comparative in vitro study on antifungal and antioxidant activities of Nervilia aragoana and Atlantia monophylla,Pharmaceutical Biology, 2010, 48 (5), 595-602.
[34]. E.K. Dilipkumar and J.G. R., Antidiabetic and regenerative effects of alcoholic corm extract of Nervilia aragoana Gaud. in streptozotocin-nicotinamide induced NIDDM rats, International Journal of Phytomedicine, 2013, 5, 207-210. [35]. E. K. Kumar and G.R. Janardhana, Antidiabetic activity of alcoholic stem extract of Nervilia plicata in streptozotocin-nicotinamide induced type 2 diabetic rats, JEthnopharmacol, 2011, 133 (2), 480-483.
[36]. A. Kimura, J.H. Lee, et al., Two potent competitive inhibitors
discriminating alpha-glucosidase family I from family II, Carbohydrate Research, 2004, 339 (6), 1035-1040.
[37]. E.A.H. Mohamed, M.J.A. Siddiqui, et al., Potent α-glucosidase and α- amylase inhibitory activities of standardized 50% ethanolic extracts and sinensetin from Orthosiphon stamineus Benth as anti-diabetic mechanism, BMC
[38]. M.A. Ibrahim, N.A. Koorbanally, and M.S. Islam, Antioxidative activity and inhibition of key enzymes linked to type-2 diabetes (alpha-glucosidase and alpha-amylase) by Khaya senegalensis, Acta Pharmaceutica, 2014, 64 (3), 311-324.
[39]. S. Chiba, Molecular mechanism in alpha-glucosidase and
glucoamylase, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1997, 61 (8), 1233- 1239.
[40]. N.F. Brás, N.M. Cerqueira, et al., Glycosidase inhibitors: a patent review (2008 – 2013), Expert Opinion on Therapeutic Patents, 2014, 24 (8), 857- 874.
[41]. E. Borges de Melo, A. da Silveira Gomes, and I. Carvalho, α- and β- Glucosidase inhibitors: chemical structure and biological activity, Tetrahedron, 2006, 62 (44),10277-10302.
[42]. N. Asano, Sugar-mimicking glycosidase inhibitors: bioactivity and application, Cellular and Molecular Life Sciences, 2009, 66 (9), 1479-1492.
[43]. N. Asano, Glycosidase inhibitors: update and perspectives on practical use, Glycobiology, 2003, 13 (10), 93-104.
[44]. A. Balakrishna and H.K. Manikyam, Evaluation of Synergetic
Anticancer Activity of Berberine and Curcumin on Different Models of A549, Hep- G2, MCF-7, Jurkat, and K562 Cell Lines, BioMed research international, 2015, 2015, 354614.
[45]. M. Meor Ahmad, S.R. Wan Alwi, et al., Review of hepatoprotective agents in herbs, Journal of Engineering Science and Technology, 2015, 10, 14-24. [46]. A. Shafei, W. El-Bakly, et al., A review on the efficacy and toxicity of different doxorubicin nanoparticles for targeted therapy in metastatic breast cancer, BiomedPharmacother, 2017, 95, 1209-1218.
[47]. M. Houshmand, G. Simonetti, et al., Chronic myeloid leukemia stem cells, Leukemia, 2019, 33 (7), 1543-1556.
[48]. C. Chen, L. Lu, et al., Autophagy and doxorubicin resistance in cancer, Anticancer Drugs, 2018, 29 (1), 1-9.
[49]. C. Cristina, X.S. Renato, et al., Doxorubicin: The Good, the Bad and the Ugly Effect, Current Medicinal Chemistry, 2009, 16 (25), 3267-3285.
[50]. A. Varela-López, M. Battino, et al., An update on the mechanisms related to cell death and toxicity of doxorubicin and the protective role of nutrients,