2.3.3.1. Phương pháp thử hoạt tính ức chế α-glucosidase [38] a. Nguyên tắc
Enzyme α-glucosidase khi gặp liên kết α-O-glycoside sẽ cắt đứt liên kết này để giải phóng đường D-glucose. Sử dụng cơ chất có liên kết α với đường D-glucose như p- nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG), dưới tác dụng của enzyme α-glucosidase sẽ bị thủy phân cho ra đường D-glucose và p-nitrophenol. p-Nitrophenol hấp thu trong vùng ánh sáng nhìn thấy được, nên tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 405 nm. Từ đó xác định được lượng D-glucose sinh ra.
b. Phương pháp tiến hành
Ü Chuẩn bị các dung dịch
-Enzyme được pha ở nồng độ 1,0 U/mL.
-Cơ chất pNPG được pha ở nồng độ 20 mM trong đệm phosphate pH 6,9; 5 mM trong đệm phosphate pH 6,8; 5 mM trong đệm phosphate pH 6,9.
-Dung dịch đệm phosphate pH 6,9; pH 6,8.
-Chất ức chế dương (đối chứng dương) được sử dụng là acarbose. -Các mẫu ức chế được pha ở các nồng độ khác nhau.
Ü Thực hiện phản ứng
-Trộn lẫn các dung dịch gồm dung dịch đệm, enzyme, chất ức chế với thể tích
nhất định.
-Hoạt hóa hỗn hợp ở 37oC trong 20 phút; 25oC trong 5 phút.
-Kết thúc phản ứng bằng cách thêm Na2CO3 ở nồng độ 0,1 M.
-Đo độ hấp thu của các mẫu ở bước sóng 405 nm, dựa vào đường chuẩn để xác
định lượng glucose sinh ra, từ đó xác định % ức chế và suy ra chỉ số IC50.
c. Tính kết quả
Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với p-nitrophenol. Vì vậy có thể đo độ hấp thu cực đại của p-nitrophenol để xác định lượng glucose sinh ra. So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu có ức chế (mẫu thử) và mẫu không ức chế (mẫu chuẩn) để xác định % ức chế Ia-Glu (%).
Ia-Glu (%) =!!" !# x 100%
!! Trong đó:
Ac: Giá trị độ hấp thu của mẫu không ức chế (mẫu chuẩn) As: Giá trị độ hấp thu của mẫu có ức chế (mẫu thử)
Dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định chỉ số IC50.
2.3.3.2. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào [59] a. Nguyên tắc
Các dòng tế bào khối u MCF-7, HepG2 và K562 được nuôi và cấy vào môi trường có chứa hoạt chất theo dãy nồng độ, sau đó đo lượng tế bào sống sót để đánh giá hoạt tính của mẫu chất.
b. Phương pháp tiến hành
ÜChuẩn bị môi trường và các dung dịch
Môi trường: RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute) hoặc DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), bổ sung 10% FBS (Fetal Bovine Serum), penicillin 100 IU/mL và streptomycin 100 μg/mL; duy trì ở 37oC, CO2 5% và độ ẩm 95%.
Đối chứng dương: Thuốc chống ung thư doxorubicin pha trong DMSO. Đối chứng âm: DMSO.
Các dung dịch: DMSO (Dimethyl Sulfoxide), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). Dung dịch MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 5 mg/mL pha trong PBS (Phosphate Buffered Saline).
Ü Cách tiến hành
Các tế bào sống được đã được đếm và cấy vào đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào/100 μl/giếng đối với MCF-7, HepG2 và 105 tế bào/100 μl/giếng đối với K562.
Sau 24 giờ, các tế bào được xử lý bằng mẫu thử và doxorubicin (đối chứng dương) được pha loãng trong môi trường nuôi cấy ở nồng độ 100, 50, 25, 12,5; 6,25; 3,125 và 0 μg/mL tương ứng 1%, 0,5%; 0,25%; 0,125%; 0,0625%; 0,03125% và 0%. DMSO trong môi trường nuôi cấy được sử dụng như một đối chứng âm và môi trường nuôi cấy không có tế bào được sử dụng làm mẫu trắng. Tất cả các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần.
Các đĩa được ủ ở 37oC, CO2 5% và độ ẩm 95% trong 72 giờ. Sau đó, thêm vào mỗi giếng 10 μl MTT 5 mg/mL và ủ ở 37oC, CO2 5% trong 3,5 giờ. Thêm vào mỗi giếng 70 μl SDS 10% và ủ ở 37oC trong 16 giờ. Đo độ hấp thu của mỗi giếng bằng máy quang phổ quét Sunrise ở bước sóng 595 nm.
c. Tính kết quả
Giá trị CS: Tỷ lệ sống sót của tế bào được đo bằng tỷ lệ phần trăm độ hấp thụ so với đối chứng âm tính (DMSO).
CS (%) =!#" !$%&' x 100%
!
!" !
$%&' Trong đó:
Ac: Giá trị độ hấp thu của mẫu chứng dương As: Giá trị độ hấp thu của mẫu thử
ADMSO: Giá trị độ hấp thu của mẫu chứng âm
Dựng đường biểu diễn giữa %CS và nồng độ mẫu thử để xác định chỉ số IC50.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Xác định cấu trúc các hợp chất
Như đã trình bày trong phần thực nghiệm (mục 2.3.1), bột cây N. aragoana (4 kg) được ngâm chiết trong dung môi EtOH 96% thu được cao tổng EtOH - NA.Et (280,0 g). Chiết phân đoạn bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng, thu được các cao phân đoạn bao gồm cao n-hexane - NA.H (110,0 g), cao CHCl3 - NA.C (25,0 g), cao EtOAc - NA.E (90,0 g) và cao nước - NA.W (45,0 g).
Các cao chiết này được xác định hoạt tính gây độc trên 2 dòng tế bào MCF-7, HepG2 ởnồng độ 100 µg/mL được trình bày ở mục 2.3.3.2. Thử nghiệm được tiến hành tại Phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử, Bộ môn Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh thu được kết quả sau:
Bảng 3.1. Hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết Dòng tế bào Cao chiết
NA.Et NA.H MCF-7 NA.C NA.E NA.Et NA.H HepG2 NA.C NA.E
Kết quả thử nghiệm cho thấy các loại cao chiết đều không có hoạt tính gây độc trên 2 dòng tế bào MCF-7 và HepG2.
Phương pháp xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase của cao tổng và các cao phân đoạn được trình bày trong mục 2.3.3.1. Thử nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Hóa dược, khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh cho kết quả như sau:
Bảng 3.2. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của cao chiết Cao chiết NA.Et NA.H NA.C NA.E Acarbose
Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các loại cao chiết thể hiện ở (Bảng 3.2) cho thấy: Giá trị IC50 của các loại cao thu được đều thấp hơn so với đối chứng acarbose 138,4 (µg/mL), chứng tỏ hoạt tính kháng enzyme α-glucosidase của các loại cao chiết này cao, và tăng dần theo thứ tự: Cao tổng chiết trong EtOH (NA.Et), cao n-hexane (NA.H), cao EtOAc (NA.E) và cao CHCl3 (NA.C) tương ứng 79,9; 37,6; 35,4 và 18,4 (µg/mL).
Từ kết quả xác định hoạt tính cho thấy các loại cao chiết đều không có hoạt tính gây độc tế bào MCF-7 và HepG2, nhưng hoạt tính ức chế α-glucosidase thể hiện mạnh ở cao NA.H, NA.E và NA.C. Tuy nhiên, kết quả TLC của cao NA.H, NA.C có các vết tương đồng, nhưng ở cao NA.H nhiễm béo nhiều, do đó, cao NA.C và NA.E được sử dụng để tiến hành phân lập.
Cao NA.C (25 g) tiến hành CC và TLC đã phân lập được 9 hợp chất, ký hiệu lần lượt là NA.03 (6,0 mg ), NA.04 (26,0 mg), NA.05 (12,0 mg), NA.06 (17,0 mg), NA.07 (12,0 mg), NA.08 (8,0 mg), NA.09 (15,0 mg), NA.10 (14,0 mg), NA.11 (10,0 mg).
Cao NA.E (90,0 g) tiến hành CC và TLC đã phân lập được 16 hợp chất, ký hiệu lần lượt là NA.01 (10,0 mg), NA.02 (14,0 mg), NA.12 (20,0 mg), NA.13 (8,0 mg), NA.14 (18,0 mg), NA.15 (32,0 mg), NA.16 (17,0 mg), NA.17 (11,0 mg), NA.18 (15,0 mg), NA.19 (10,0 mg), NA.20 (23,0 mg), NA.21 (14,0 mg), NA.22 (17,0 mg), NA.23 (8,0 mg), NA.24 (14,0 mg) và NA.25 (26,0 mg).
Sau đây là phần biện luận để xác định cấu trúc của các hợp chất trên.
3.1.1. Các hợp chất thuộc nhóm cycloartane
3.1.1.1. Hợp chấtNA.01 (nerviside I, chất mới)
Hình 3.1. Cấu trúc hóa học và tương quan HMBC, NOESY của hợp chấtNA.01 Hợp chấtNA.01 được phân lập từ cao NA.E (Sơ đồ 2.3), thu được dạng bột, màu
trắng.
Phổ khối HR-ESI-MS (Phụ lục 1.1) của hợp chất NA.01 cho mũi ion phân tử giả [M-H]- tại m/z 651,4103 so với lý thuyết có m/z 651,4114; sai số 1,1 mmass, phù hợp công thức phân tử là C36H60O10.
Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δH ppm) (Phụ lục 1.2) của hợp chất NA.01
cho thấy ở vùng trường cao xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 1 cặp mũi đôi proton geminal ở δH 0,36 và δH 0,56 (1H; d; 4,0; H2-19) tương ứng với các proton methylene ở vị trí 19 của vòng cyclopropane của một cycloartane triterpene [60, 61]; 2 proton oxy methine ở δH 3,34 (1H, brs, H-1); 4,40 (1H; dd; 12,0; 4,5; H-3); 6 tín hiệu proton methyl ở δH 0,91 (3H, s, H-18), 0,82 (3H, s, H-21), 0,80-0,82 (3H; m; H-26, H-27), 0,97 (3H, s, H-29) và 0,89 (3H, s, H-30). Ngoài ra, xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng của proton anomer phân tử đường ở δH 4,14 (1H; d; 7,5; H-1'), các proton oxy methine và oxy methylene phân tử đường cộng hưởng trong vùng 2,88-3,66 ppm.
Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, δC ppm) (Phụ lục 1.3), phổ DEPT (Phụ lục
1.4) và phổ HSQC (Phụ lục 1.5) của hợp chất NA.01 cho 36 tín hiệu carbon, trong đó 31 tín hiệu có thể được gắn cho khung triterpenoid và 5 tín hiệu còn lại thuộc về đơn vị monosaccharide. 31 tín hiệu carbon cộng hưởng của phần aglycone bao gồm 6 carbon methyl ở δC 18,0 (C-18), 18,3 (C-21), 17,1 (C-26, C-27), 9,5 (C-29) và 19,1 (C-30); 11 nguyên tử carbon methylene ở δC 36,1 (C-2), 22,0 (C-6), 25,1 (C-7), 25,0 (C-11), 32,6 (C- 12), 35,3 (C-15), 27,8 (C-16), 28,8 (C-19), 29,0 (C-22), 30,8 (C-23) và 64,7 (C-31) nối với oxy; 8 nguyên tử carbon methine ở δC 36,6 (C-5), 47,5 (C-8), 51,9 (C-17), 36,4 (C- 20), 32,3 (C-25), và 70,8 (C-1), 78,8 (C-3) mang oxy; và 7 carbon tứ cấp ở δC 53,0 (C-4), 21,1 (C-9), 28,9 (C-10), 44,8 (C-13), 48,7 (C-14) và 74,6 (C-24) nối với oxy (C-24) và 1 carbon carboxyl δC 178,5 (C-28). Tín hiệu cộng hưởng của đơn vị đường bao gồm δC
104,1 (C-1'); 73,7 (C-2'); 76,4 (C-3'); 69,6 (C-4') và 65,7 (C-5').
Phân tích kết hợp phổ HMBC (Phụ lục 1.6), COSY (Phụ lục 1.7) đã xác định được đầy đủ các tín hiệu 1H và 13C cho hợp chấtNA.01 (Bảng 3.4).
Phân tích phổ hai chiều HMBC (Phụ lục 1.6) cho thấy trong vòng A, 1 nhóm methyl và 1 gốc carboxylic acid cùng nối vào vị trí δC 53,0 (C-4) dựa trên tương quan HMBC của cả proton oxy methine ở δH 4,40 (H-3) và methyl ở δH 0,97 (3H, s, H-29) với carbon ở δC 53,0 (C-4) và δC 178,5 (C-28), cũng như 3 proton ở δH 0,97 (3H, s, H-29) tương quan với carbon ở δC 78,8 (C-3). Ngoài ra, 1 nhóm hydroxyl được gắn ở vị trí δC
70,8 (C-1) dựa trên tương quan của các proton ở δH 0,36 và δH 0,56 (1H; d; 4,0; H-19), δH
4,40 (1H; dd; 12,0; 4,5; H-3) và δH 2,41 (1H; dd; 12,5; 4,0; H-5) đến vị trí δC 70,8 (C-1) và tương quan của proton δH 3,34 (1H, brs, H-1) đến carbon ở δC 36,1 (C-2), δC 78,8 (C-3) và δC 36,6 (C-5). Tín hiệu H-1 xen lẫn tín hiệu của nước cộng hưởng ở δH 3,34 ppm ở dạng mũi đơn rộng, cho thấy sự xuất hiện của nhóm α-hydroxyl [62].
Tín hiệu H-3 xuất hiện dưới dạng mũi đôi có hằng số ghép cặp Jaa = 12,0 Hz và Jae
=4,5 Hz xác định vị trí β-hydroxyl [63-65]. Độ dịch chuyển ở δC 78,8 (C-3) của aglycone chỉ ra rằng monosaccharide được liên kết tại vị trí này, điều này còn được thấy ở tương quan HMBC của proton ở δH 4,14 (1H; d; 7,5; H-1') với δC 78,8 (C-3). Vùng δH 2,5-4,5 ppm
của phổ 1H-NMR xác nhận sự xuất hiện của 1 saccharide duy nhất, được xác định là β-xylose dựa trên tín hiệu mũi ba proton ở δH 2,97 (1H; t; 11,5; H-5') và δH 3,66 (1H; dd; 11,5;
5,0; H-5') [62]. Cấu hình β-xylopyranose được khẳng định dựa vào hằng số ghép lớn của proton anomer của H-1' (J = 7,5 Hz).
Phổ HMBC cho thấy mối tương quan giữa proton oxy methylene cộng hưởng ở δH
3,25 (2H, m, H-31) với δC 30,8 (C-23), δC 74,6 (C-24) và δC 32,3 (C-25) xác định sự xuất hiện của nhóm hydroxy methyl ở C-24, giống với chuỗi của các chất nerviside đã được báo cáo trước đây [66, 67].
Phổ COSY (Phụ lục 1.7) của hợp chất NA.01 cho thấy mối tương quan của tất cả các proton trong vòng xylopyranose, về độ dịch chuyển hóa học cũng như các giá trị hằng số ghép cặp hoàn toàn phù hợp với các giá trị J được báo cáo trước đây đối với gốc đường
β-D-xylopyranose [68-70].
Phổ NOESY (Phụ lục 1.8) của hợp chất NA.01 cho thấy các tương quan giữa các proton ở δH 3,34 (1H, brs, H-1), δH 0,36 và δH 0,56 (1H; d; 4,0; H-19), và δH 0,97 (3H, s, H-29) xác định hướng β của chúng, do đó vị trí α của nhóm 4-COOH cũng được xác định. Hóa học lập thể của các vòng A/B/C/D [71] được cung cấp bởi dữ liệu 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chấtNA.01 gần giống với các cycloartane triterpene [72], nerviside A- C [19], nerviside D-H [22], và chuỗi cyclopassifloic acid [73], và được hỗ trợ bởi các mối tương quan NOESY. Phổ của các carbon mạch nhánh hầu như không ảnh hưởng đến hệ thống các vòng của dẫn xuất triterpene [74]. Hơn nữa, mạch nhánh không nhạy cảm với những thay đổi cấu trúc từ carbon bất đối [75], nên chúng có thể được sử dụng để xác định cấu hình tuyệt đối của C-24 trong một số sterol. Vì vậy, để xác định cấu hình tuyệt đối ở C-24, các phép tính độ dịch chuyển hóa học 13C-NMR của mô hình đơn giản chỉ bao gồm hai vòng C và D, được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp cấu trúc điện tử trên các cấu trạng có năng lượng thấp nhất trong cả hai đồng phân epimer C-24 được xác định nhanh chóng bằng cách quét bề mặt năng lượng với tọa độ ban đầu có sẵn trong các CIF tinh thể học tia X liên quan đến các dẫn xuất của cycloartane [76-78]. So sánh dữ liệu 13C-NMR mô phỏng của hai epimer có thể có với dữ liệu phổ thực tế dẫn đến dự đoán cấu hình 24R với độ tin cậy là 99,2% (Bảng 3.3).
Bảng 3.3. Kết quả tính toán DFT cho hai epimer 24R và 24S của hợp chấtNA.01
Vị trí C-24
Nerviside D Nerviside C Hình 3.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất nerviside C, D
Từ những dữ liệu trên và so sánh với tài liệu [22] (Bảng 3.4) và (Hình 3.2), hợp chất NA.01 là 3β-O-D-xylopyranosyl-1a,24R,31-trihydroxylcycloartan-28-oic acid. Kiểm tra trên Scifinder ngày 17/04/2019 tại trường Đại học Chulalongkorn Thái Lan cho kết quả chất mới, được đặt tên là nerviside I (Hình 3.1).
Bảng 3.4. Dữ liệu phổ NMR của hợp chấtNA.01
Vị Hợp chất trí 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Nerviside D (C5D5N) [22] δH (J, Hz) 3,88 (1H, brs) 2,25-2,31 (1H, m); 2,75-2,80 (1H, m) 5,50 (1H; dd; 12,1; 4,3) 3,40 (1H; dd; 10,8; 3,2) 1,20*; 1,75* 1,24*; 1,40* 1,53* 1,39*; 2,67-2,72 (1H, m) 1,55*; 1,67* 1,14-1,20 (1H, m); 1,28*
18 0,36 (1H; 19 0,56 (1H; 20 21 22 23 24 25 26 0,80-0,82 (3H, 27 0,80-0,82 (3H, 28 29 30 31 1' 4,14 (1H; 2,88 (1H; 2' 3' 3,05 (1H; 4' 3,66 (1H; 5' 2,97 (1H; * overlapped signals
3.1.1.2. Hợp chấtNA.02 (nerviside J, chất mới)
Hợp chất NA.02 được phân lập từ cao NA.E (Sơ đồ 2.3), dạng chất rắn vô định hình, màu trắng.
Phổ khối HR-ESI-MS (Phụ lục 2.1) của hợp chất NA.02 cho mũi ion phân tử giả [M-H]- tại m/z 693,4215 so với lý thuyết có m/z 693,4219; sai số 0,4 mmass, phù hợp công thức phân tử là C38H62O11. Điều này gợi ý rằng NA.02 khác với NA.01 là có thêm nhóm acetyl.
Theo đó, cả dữ liệu phổ 1H-NMR (Phụ lục 2.2) và 13C-NMR (Phụ lục 2.3) và DEPT (Phụ lục 2.4) rất giống nhau giữa hai hợp chất, nhưng phổ 1H-NMR của NA.02
cho thấy 1 nhóm methyl nữa cộng hưởng ở δH 1,99 (3H, s), bên cạnh đó phổ 13C-NMR thể hiện thêm 1 carbon carbonyl ở δC 170,3 và carbon methyl ở δC 20,7.
Phân tích kết hợp phổ HSQC (Phụ lục 2.5), HMBC (Phụ lục 2.6), COSY (Phụ lục
2.7) và NOESY (Phụ lục 2.8) xác định được đầy đủ các tín hiệu 1H và 13C và các tương quan trên cấu trúc phân tử hợp chất NA.02.
Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR của hợp chấtNA.02
V ị trí 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Hợp chấtNA.02 (DMSO-d6) Nerviside C
(C5D5N) [19] δH (J, Hz) 3,86 (1H, brs) 2,28 (1H, m); 2,76 (1H, m) 5,49 (1H; dd; 12,0; 4,4) 3,39 (1H; dd; 12.0; 4,1) 1,22*; 1,75* 1,24*; 1,38* 1,55 (1H, m) 1,40 (1H, m); 2,69 (1H, m) 1,50*; 1,67* 1,18*; 1,33*
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 1' 2' 3' 4' 5' OAc * overlapped signals
Phổ hai chiều HMBC thể hiện mối tương quan của khung cycloartane glycoside tương tự như trong hợp chấtNA.01, ngoại trừ sự acetyl hóa của nhóm hydroxyl ở C-31 do có sự tương quan HMBC từ proton methyl ở δH 1,99 đến carbon carbonyl ở δC 170,3 (C- 32), cũng như từ proton δH 3,89 và 3,85 (2H; d; 11,0; H-31) đến δC 170,3 (C-32), điều này cho thấy có sự xuất hiện của 1 nhóm acetyl trong cấu trúc của NA.02. Ngoài ra, cấu hình C-24R hoàn toàn tương tự với hợp chất NA.01 dựa trên sự giống nhau giữa các tín hiệu carbon C-23, C-24 và C-25.
Từ những dữ liệu trên và so sánh với tài liệu [19] (Bảng 3.5) và (Hình 3.2), hợp chất NA.02 là 3β-O-D-xylopyranosyl-31-O-acetyl-1α,24R-dihydroxycycloartan-28-oic acid.Kiểm tra trên Scifinder ngày 17/04/2019 tại trường Đại học Chulalongkorn Thái Lan cho kết quả chất mới, được đặt tên là nerviside J (Hình 3.3).
3.1.2. Hợp chất thuộc nhóm benzofuran - Hợp chất NA.03 (nervione, chất mới)
Hình 3.4. Cấu trúc hóa học và tương quan HMBC, NOESY của hợp chất NA.03 Hợp
chấtNA.03 được phân lập từ cao NA.C (Sơ đồ 2.2), dạng bột vô định hình, màu trắng.
Phổ khối HR-ESI-MS (Phụ lục 3.1) của hợp chấtNA.03 xuất hiện mũi ion phân tử giả [M+Na]+ ở m/z 271,0576 so với lý thuyết có m/z 271,0582; sai số 0,6 mmass, phù hợp