Chương II : THỰC NGHIỆM
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.6. Nghiên cứu giảm kích thước tiểu phân
Phương pháp hydrate hóa màng lipid thường tạo ra hạt liposome đa lớp và có kích thước lớn, do đó liposome sau bào chế cần được giảm kích thước hạt bằng
thiết bị đồng nhất mẫu. Nghiên cứu sử dụng phương pháp siêu âm kết hợp phương pháp đồng hóa:
- Siêu âm (thiết bị siêu âm Elma S 80 H): 40 phút.
- Đồng hóa (máy đồng hóa áp suất cao Emulsiglex C5): 800 bar, 10 chu kỳ. 2.2.7. Nang hóa hoạt chất vào hệ liposome
2.2.7.1. Khảo sát lượng tá dược tạo khung
Hệ phân tán liposome sau khi giảm kích thước được đơng khơ với maltodextrin. Khảo sát hàm lượng sử dụng với các tỷ lệ maltodextrin:lipid lần lượt là 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 và 1:5. Lượng tá dược maltodextrin sử dụng được đánh giá dựa trên cảm quan, kích thước trung bình của tiểu phân, chỉ số đa phân tán và thế zeta.
2.2.7.2. Khảo sát tỷ lệ lượng cao chứa dược chất nang hóa vào hệ liposome
Khảo sát tỷ lệ lipid:cao dược chất lần lượt là 1:1, 2:1, 3:1, 4:1. Vì shogaol (cao gừng), apigenin (cao cần tây) và kém tan trong nước nên được phân tán vào pha lipid trong q trình bào chế. Trong khi đó fucoidan (cao rong nâu) tan tốt trong nước nên được phân tán vào pha nước chứa Tween 80. Kết quả khảo sát lượng cao chứa dược chất được nang hóa vào liposome được đánh giá dựa trên cảm quan và độ ổn định ở điều kiện 2-8oC sau một tuần bảo quản.
2.2.7.3. Khảo sát lượng tác nhân hướng đích Tween 80-EDA-FA
Khảo sát tỷ lệ Tween 80-EDA-FA lần lượt là 10%, 15%, 20% tổng khối lượng liposome. Kết quả khảo sát lượng tác nhân hướng đích Tween 80-EDA-FA được đánh giá dựa trên cảm quan và độ ổn định ở điều kiện 2-8oC sau một tuần bảo quản.
2.2.7.4. Khả năng nang hóa hoạt chất
Hiệu suất nang hóa thuốc của liposome được xác định thơng qua việc định lượng shogaol (cao gừng), fucoidan (cao rong nâu), apigenin (cao cần tây) được nang hóa vào liposome bằng HPLC. Lượng hoạt chất tự do trong hệ phân tán liposome bị loại đi khi lọc mẫu qua màng MWCO 3500 Dalton. Lượng hoạt chất được nang hóa vào liposome được tính tốn bằng hiệu số giữa lượng hoạt chất tồn phần và lượng hoạt chất tự do theo công thức:
Hiệu suất nang hóa thuốc (%) = Khối lượng thuốc được nang hóa vào liposome 100 Khối lượng thuốc toàn phần
Chương III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Tổng hợp EDA-FA ở quy mơ phịng thí nhiệm 3.1. Tổng hợp EDA-FA ở quy mơ phịng thí nhiệm
3.1.1. Xác định cấu trúc hóa học
Hình 3.1. Phổ FT-IR của FA, EDA, EDA-FA
Phân tích phổ hồng ngoại FT-IR của sản phẩm EDA-FA trong khoảng từ 4000- 400 cm-1, có tín hiệu tại 3415-3265 cm-1 của amine bậc 2 (-N-H-); 1645 cm-1 của C=O (liên kết amide) và 1556 cm-1 là dao động uốn cong của liên kết N-H.
Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của Acid Folic
-NH- C=O -N-H 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 EDA-FA FA cm-1 EDA
Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của EDA-FA
Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của sản phẩm EDA-FA cho thấy, trong cấu trúc EDA-FA có các proton có độ chuyển dịch hóa học điển hình: 1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) 1.90~2.25 (4H, C23, C24), 2.79 ( 2H, C32), 4.19 - 4.47 (7H, C12, N34, C22, C33), 6.63 - 6.65 ( 2H, C15, C19), 6.85 -6.88 (3H, N11, N13), 7.58 - 7.60 (2H, C16, C18), 7.78 (1H, N21), 8.62 (1H, C8). Độ chuyển dịch hóa học của mẫu EDA-FA tổng hợp phù hợp với độ dịch chuyển hóa học của Liu, Li et al. và Trindade, Frade et al [5].
Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của sản phẩm EDA-FA cho thấy, trong cấu trúc EDA-FA có các carbon có độ chuyển dịch hóa học điển hình: 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) 27.99~31.77 (C23, C24), 39.00-41 (C32, C32), 46.1 (C12), 53.87 (C22), 11.24 (C15, C19),122.26 (C17), 128.11 (C16, C18), 147.79 (C8, C9), 150.33 (C14), 154~155 (C4, C2), 164.49 (C20), 175.66 (C25, C28,C6). Độ chuyển dịch hóa học của mẫu EDA-FA tổng hợp phù hợp với độ dịch chuyển hóa học của Trindade, Frade et al. [5].
Kết quả phân tích hồng ngoại FT-IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và
13C-NMR chứng minh sản phẩm EDA-FA có cấu trúc đúng với cấu trúc EDA-FA theo lý thuyết.
3.1.2. Khảo sát và xây dựng quy trình tổng hợp EDA-FA
a) Hiệu suất tổng hợp EDA-FA theo nhiệt độ
Kết quả thực hiện phản ứng tổng hợp EDA-FA với tỉ lệ mol EDA/FA (1 : 1), thời gian phản ứng 12 giờ và nhiệt độ phản ứng thay đổi từ nhiệt độ phòng đến 80 ℃ được thể hiện ở Bảng 3.1 và Hình 3.5.
Bảng 3.1. Hiệu suất tổng hợp EDA-FA theo nhiệt độ
Nhiệt độ (℃) Phân tử lượng (g/mol) Số mol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) RT 483,5 1 0,4835 0,3020 62,53 60 483,5 1 0,4835 0,3814 78,97 70 483,5 1 0,4835 0,3601 74,55 80 483,5 1 0,4835 0,3493 72,31
Hình 3.5. Hiệu suất tổng hợp EDA-FA theo nhiệt độ
Từ kết quả ở Bảng 3.1 và Hình 3.5 cho thấy phản ứng tổng hợp EDA-FA đạt hiệu suất cao nhất ở 60 ℃ (78,97%) nên sử dụng 60 ℃ để khảo sát thời gian phản ứng và tỉ lệ mol EDA/FA.
Kết quả thực hiện phản ứng tổng hợp EDA-FA tỉ lệ mol EDA/FA (1:1), nhiệt độ 60 ℃ và thời gian phản ứng từ 8 giờ đến 16 giờ được thể hiện ở Bảng 3.2 và Hình
3.6.
Bảng 3.2. Hiệu suất tổng hợp EDA-FA theo thời gian
Thời gian (giờ) Phân tử lượng (g/mol) Số mol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) 8 483,5 1 0,4835 0,3038 62,90 10 483,5 1 0,4835 0,3415 70,70 12 483,5 1 0,4835 0,3814 78,97 16 483,5 1 0,4835 0,3895 80,64
Hình 3.6. Kết quả hiệu suất tổng hợp EDA-FA theo thời gian phản ứng
Kết quả ở Bảng 3.2 và Hình 3.6 cho thấy phản ứng tổng hợp EDA-FA đạt hiệu suất cao nhất ở 16 giờ (80,64%). Tuy nhiên, khi phản ứng thay đổi từ 12 giờ đến 16 giờ, hiệu suất của phản ứng thay đổi khơng đáng kể. Vì vậy, sử dụng thời gian 12 giờ để khảo sát tỉ lệ mol EDA/FA.
c) Hiệu suất tổng hợp EDA-FA theo tỉ lệ mol
Kết quả thực hiện phản ứng tổng hợp EDA-FA với nhiệt độ 60 ℃, thời gian phản ứng 12 giờ và tỉ lệ mol EDA/FA thay đổi từ (1:1) đến (2:1) được thể hiện ở Bảng 3.3 và Hình 3.7.
Bảng 3.3. Hiệu suất tổng hợp EDA-FA theo tỉ lệ mol
Tỉ lệ mol Phân tử lượng (g/mol) Số mmol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) 1:1 483,5 1 0,4835 0,2935 60,77 1,2:1 483,5 1 0,4835 0,3265 67,60 1,5:1 483,5 1 0,4835 0,3814 78,96 2:1 483,5 1 0,4835 0,3841 79,52
Hình 3.7. Hiệu suất tổng hợp EDA-FA theo tỉ lệ mol
Từ kết quả ở Bảng 3.3 và Hình 3.7 cho thấy phản ứng tổng hợp EDA-FA đạt hiệu suất cao nhất ở tỉ lệ mol (2:1) (79,52%). Tuy nhiên, khi thay đổi tỉ lệ mol EDA/FA từ (1,5:1) đến (2:1), hiệu suất của phản ứng thay đổi không đáng kể. Vì vậy sử dụng tỉ lệ mol EDA/FA (1,5:1) để thực hiện phản ứng tổng hợp EDA-FA.
Từ kết quả khảo sát về hiệu suất phản ứng tổng hợp EDA-FA thay đổi theo nhiệt độ, thời gian phản ứng và tỉ lệ mol EDA-FA, sử dụng nhiệt độ 60 ℃, thời gian phản ứng 12 giờ, tỉ lệ mol EDA/FA (1,5:1) để thực hiện phản ứng tổng hợp EDA-FA quy mô 30 g/mẻ và sử dụng sản phẩm EDA-FA này làm tác chất cho các phản ứng sau.
3.1.3. Tổng hợp EDA-FA quy mô 30 g/mẻ
▪ Quy trình tổng hợp EDA-FA
Hình 3.8. Quy trình tổng hợp EDA-FA quy mô 30 g/mẻ
Cân đong nguyên liệu
Acid folic Natri hydroxit
Hòa tan
Máy khuấy từ (300 rpm, 10 phút)
Khuấy đều
Máy khuấy từ (300 rpm, 60 oC, 12 giờ) Ethylenediamine Acid hydrocloric Tủa Máy đo pH (pH = 6) Ly tâm Máy ly tâm (10.000 rpm, 5 phút) Rửa tủa Nước cất (3 lần) Sấy khô Tủ sấy (65 oC, 6 giờ) Sản phẩm EDA-FA
Cách tiến hành:
Bước 1: Hòa tan 44,14 g acid folic vào 1000 mL dung dịch NaOH 0,04 M. Bước 2: Cho từ từ 12,02 g ethylene diamine vào dung dịch trên. Sau đó khuấy liên tục trong 12 giờ ở 60 oC bằng máy khuấy từ. Cho từ từ dung dịch HCl 0,2 M cho đến khi pH=6.
Bước 3: Hỗn hợp sản phẩm được ly tâm ở 10.000 rpm/5phút. Sản phẩm kết tủa được rửa 3 bằng với H2O để loại bỏ EDA thừa. Sấy khô ở 65 oC trong 6 giờ.
▪ Kết quả tổng hợp EDA-FA quy mô 30 g/mẻ
Bảng 3.4. Kết quả tổng hợp EDA-FA quy mô 30 g/mẻ
Lần Phân tử lượng (g/mol) Số mol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) 1 483,5 100 48,35 35,16 72,72 2 483,5 100 48,35 34,34 71,02 3 483,5 100 48,35 34,89 72,16 Trung bình 34,80 71,99 %RSD 1,2
Kết quả từ Bảng 3.4 cho thấy quy trình tổng hợp EDA-FA có tính ổn định và lặp lại (%RSD = 1,2 ). Hiệu suất tổng hợp trung bình đạt 71,99 %.
3.2. Tổng hợp Tween 80-EDA-FA quy mơ phịng thí nghiệm
3.2.1. Xác định cấu trúc hóa học1
Hình 3.8. Phổ UV-Vis của FA, EDA-FA, Tween 80-EDA-FA, Tween 80
200 300 400 500 600 700 800 FA FA-EDA FA-EDA-Tween TWEEN nm
Kết quả phân tích phổ UV-Vis cho thấy sản phẩm tổng hợp Tween 80-EDA-FA có khoảng hấp thu đặc trưng ở bước sóng 220-250 nm tương ứng với phổ hấp thu của Tween 80. Ngồi ra, sản phẩm Tween 80-EDA-FA cịn có khoảng hấp thu đặc trưng ở bước sóng 280-300 nm tương ứng với phổ hấp thu của EDA-FA.
Hình 3.9. Phổ FT-IR của Tween 80-EDA-FA, Tween 80, EDA-FA
Kết quả phân tích phổ FT-IR của sản phẩm Tween 80-EDA-FA trong khoảng 4000 - 400 cm -1 cho thấy có tín hiệu ở 3298 cm-1 của nhóm amine bậc 2 (-NH-) của EDA-FA; 2927 cm-1 và 1608 cm-1 của nhóm CH3-CH2- và -CH=CH- của Tween 80.
Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của Tween 80-EDA-FA
Phổ 1H-NMR của sản phẩm Tween 80-EDA-FA cho thấy, trong cấu trúc Tween 80-EDA-FA có các proton có độ chuyển dịch hóa học điển hình: 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) 0,83-0,86 (3H, C1’), 1,23 (14H, C2’), 1,51 (2H, C3’), 1,91-1,95 (10H, C4’, C23), 2,22-2,26 (10H, C4’, C24), 6,63-6,65 (6H, C15, C19), 7.59-7,61 (6H, C16, C18). 4000 3000 2000 1000 Tween-EDA-FA Tween cm-1 EDA-FA CH3-CH2- -CH=CH-
Độ chuyển dịch hóa học của mẫu Tween 80-EDA-FA tổng hợp phù hợp với độ dịch chuyển hóa học của Liu, Li et al. và Trindade, Frade et al [5].
Kết quả phân tích UV-Vis, hồng ngoại FT-IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- NMR chứng minh sản phẩm Tween 80-EDA-FA có cấu trúc đúng với cấu trúc Tween 80-EDA-FA theo lý thuyết.
3.2.2. Khảo sát và xây dựng quy trình tổng hợp Tween 80-EDA-FA
a) Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo tỉ lệ mol
Kết quả thực hiện phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA ở nhiệt độ độ phòng, thời gian phản ứng 12 giờ và tỉ lệ mol Tween 80/EDA-FA thay đổi từ 1:1 đến 1:3 được thể hiện ở Bảng 3.5 và Hình 3.11.
Bảng 3.5. Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo tỉ lệ mol
Tỉ lệ mol Phân tử lượng (g/mol) Số mmol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) 1:1 2803,5 1 2,8035 1,1366 40,54 1:1,5 2803,5 1 2,8035 1,3274 47,35 1:2 2803,5 1 2,8035 1,5204 54,23 1:3 2803,5 1 2,8035 1,8012 64,24
Hình 3.11. Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo tỉ lệ mol
Kết quả thu được từ Bảng 3.53 và Hình 3.44 cho thấy hiệu suất phản ứng tăng khi tỉ lệ mol Tween 80/EDA-FA tăng từ 1:1 (40,54%) đến 1:3 (64,24%). Vì vậy sử dụng tỉ lệ mol Tween 80/EDA-FA (1 : 3) để khảo sát nhiệt độ và thời gian phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA.
b) Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo nhiệt độ
Kết quả thực hiện phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA với tỉ lệ mol Tween 80/EDA-FA (1:3), thời gian phản ứng 12 giờ và nhiệt độ phản ứng thay đổi từ nhiệt độ phòng đến 80 ℃ được thể hiện ở Bảng 3.54 và Hình 3.45.
Bảng 3.6. Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo nhiệt độ Nhiệt độ Nhiệt độ (℃) Phân tử lượng (g/mol) Số mmol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) RT 2803,5 1 2,8035 1,7966 64,08 60 2803,5 1 2,8035 1,8013 64,25 70 2803,5 1 2,8035 1,8089 64,52 80 2803,5 1 2,8035 1,8152 64,75
Hình 3.12. Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo nhiệt độ
Kết quả ở Bảng 3.6 và Hình 3.12 cho thấy hiệu suất của phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng. Hiệu suất của phản ứng tăng từ 64,08% (nhiệt độ phòng) đến 64,75% (80℃). Do hiệu suất của phản ứng tăng không đáng kể nên chúng tơi chọn nhiêt độ phịng để khảo sát thời gian phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA.
c) Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo thời gian phản ứng
Kết quả thực hiện phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA với tỉ lệ mol Tween 80/ EDA-FA (1:3), ở nhiệt độ phòng và thời gian phản ứng thay đổi từ 8 giờ đến 16 giờ được thể hiện ở Bảng 3.7 và Hình 3.13.
Bảng 3.7. Kết quả hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo thời gian phản ứng
Thời gian (giờ) Phân tử lượng (g/mol) Số mmol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) 8 2803,5 1 2,8035 1,6534 58,98 10 2803,5 1 2,8035 1,7168 61,24 12 2803,5 1 2,8035 1,7966 64,08 16 2803,5 1 2,8035 1,8015 64,26
Hình 3.13. Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo thời gian
Kết quả ở Bảng 3.7 và Hình 3.13 cho thấy phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA- FA đạt hiệu suất cao nhất ở 16 giờ (64,26%). Tuy nhiên, khi phản ứng thay đổi từ 12 giờ đến 16 giờ, hiệu suất của phản ứng thay đổi khơng đáng kể. Vì vậy, chúng tơi sử dụng thời gian 12 giờ để thực hiện phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA.
Kết luận: Từ kết quả khảo sát về hiệu suất phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-
FA thay đổi theo nhiệt độ, thời gian phản ứng và tỉ lệ mol Tween 80/EDA-FA. Chúng tơi sử dụng nhiệt độ phịng, thời gian phản ứng 12 giờ, tỉ lệ mol Tween 80/EDA-FA (1 : 3) để thực hiện phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA ở quy mô 30 g/mẻ.
3.2.3. Tổng hợp Tween 80-EDA-FA ở quy mơ 30 g/mẻ
▪ Quy trình tổng hợp Tween 80-EDA-FA
Hình 3.14. Quy trình tổng hợp Tween 80-EDA-FA ở quy mô 30 g/mẻ
Tween 80, DMF
Hút chân không
Máy hút chân không (60-65 oC, 2 giờ)
Khuấy đều
Máy khuấy từ (300 rpm, 60-65 oC, 6 giờ)
Tủa
Máy đo pH (pH = 7) Cân đong nguyên liệu
EDA-FA Natri hydroxit Hòa tan Máy khuấy từ (300 rpm, 10 phút) Khuấy đều
Máy khuấy đũa (300 rpm, 12 giờ) NPC Ly tâm Máy ly tâm (10.000 rpm, 5 phút) Rửa tủa Ethanol (3 lần) Sấy khô Tủ sấy (65 oC, 6 giờ) Sản phẩm Tween 80-EDA- FA Hòa tan
Cách tiến hành:
Bước 1: Hòa tan 29,01 g EDA-FA trong 500 mL dung dịch NaOH 0,06 M, thu được dung dịch 1 (dd1).
Bước 2: Hòa tan 26,2 g Tween 80 trong 150 mL DMF, tiến hành hút chân khơng trong 2 giờ duy trì ở 60-65℃, cho từ từ 12,09 g NPC vào bình phản ứng, khuấy liên tục trong môi trường chân không ở nhiệt độ 60-65℃ trong 6 giờ.
Bước 3: Cho từ từ dd1 vào bình phản ứng, khuấy liên tục trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng. Cho từ từ dung dịch HCl 0,1 M cho đến khi pH=7. Hỗn hợp sản phẩm được ly tâm ở 10000 rpm/5phút. Sản phẩm kết tủa được rửa với ethanol sau đó được sấy khô ở 65℃ trong 6 giờ.
▪ Kết quả tổng hợp Tween 80-EDA-FA quy mô 30 g/mẻ
Bảng 3.8. Kết quả tổng hợp Tween 80-EDA-FA ở quy mô 30 g/mẻ
Lần Phân tử lượng (g/mol) Số mol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) 1 2803,5 20 56,07 35,56 63,42 2 2803,5 20 56,07 34,72 61,92 3 2803,5 20 56,07 35,13 62,65 Trung bình 35,14 62,67 %RSD 1,19
Nhận xét: Kết quả từ Bảng 3.8 cho thấy quy trình tổng hợp Tween 80-EDA-FA
có tính ổn định và lặp lại (%RSD = 1,19 ). Hiệu suất tổng hợp trung bình đạt được 62,67%.
3.3. NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ NANO VỚI CÁC CAO DƯỢC LIỆU
3.3.1. Tổng hợp hệ nano liposome quy mơ phịng thí nghiệm
a) Kết quả khảo sát tỷ lệ các thành phần cấu thành liposome
Công thức bào chế cơ bản của hệ nano liposome được thiết lập như sau: tỷ lệ