STT Tên nguyên liệu – hóa chất Hãng sản xuất
1 Bột gừng (Shogaol) Jl. Alternatif Cibubur, Indonesia, số lô 0000254494 (tháng 4/2020) 2 Bột cần tây (Apigenin) Salus Nutra Inc, China, số lô
191210 (tháng 12/2019) 3 Bột rong nâu (Fucoidan) Công ty cổ phần Fucoidan Việt
Nam, số lô 2018 (tháng 12/2018). 4 Apigenin analytical standard Sigma-Aldrich số lô BCCC0074, hàm lượng 99% apigenin 5 Shogaol analytical standard Sigma-Aldrich, số lô BCBZ1777, hàm lượng 90% shogaol 6 Fucoidan analytical standard Sigma Aldrich, số lô SLBZ7467, hàm lượng ≥ 95% fucoidan
7 Cồn công nghiệp Việt Nam
8 Hexane công nghiệp Việt Nam
9 Methanol công nghiệp Việt Nam
10 Fucose USP Reference Standard Sigma/USP
11 Ethyl acetate, for analysis Fisher
12 Ethanol, 99.8+%, for analysis,
absolute (Fisher) Fisher
13 Chloroform, 99.8+%, for analysis,
stabilized with amylene (Fisher) Fisher 14 Petroleum ether 40-60°C, for
analysis, n-hexane < 2% Fisher
15 Methanol, for analysis Fisher
16 Acetic acid 99,5% Trung quốc
17 Acetone, for analysis, CertiFied
Eur.Ph Fisher
18 Hydrochloric acid, 37%, for
analysis, d=1.18 Fisher
19 Acetonitrile for HPLC Grade Fisher
20 Sulfuric acid, min 95%, for
analysis, d=1.83 Fisher
21 Silica gel Himedia
22 Ethylenediamine ReagentPlus®, ≥
99% Sigma-Aldrich
23 4-Nitrophenyl chloroformate 96% Sigma
24 Dimethylformamide Sigma
26 Lecithin, Refined Fisher
27 Vitamin E – Acetat (96%) Germany
28 Cholesterol (95%) Fisher
29 Hydrochloric acid, 37%, for
analysis, d=1.18 Fisher
30 Acid Folic (97%) Acros
31 Natri hydroxit (99,6%) Sigma
Bảng 2.2. Danh mục trang thiết bị và dụng cụ
STT Thiết bị
1 Hệ thống cô quay chân không Eyela CCA-1111, bộ gia nhiệt OSB- 2100.
2 Máy khuấy từ IKA
3 Cân phân tích DV215CD/OHAUS 4 Bể siêu âm Ultrasonic Cleaner 5 Máy cô quay 20L
6 Hệ thống sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 7 Hệ thiết bị cất thu hồi dung môi
8 Thiết bị UV-Vis 1800, hãng Shimadzu (Nhật Bản) 9 Tủ sấy OF-12G/JEIO TECH
10 Máy quang phổ hồng ngoại (FTIR) 11 Máy khuấy đũa
12 Máy đo pH 13 Mấy sấy phun
14 Máy đo kích thước hạt Nanosizer SZ-100 15 Máy ly tâm HermLe
16 Máy ép đùn Extruder
17 Máy đồng hóa áp suất cao Emulsiflex C5-Avestin 18 Máy khuấy cánh 100 L
19 Hệ thống đông khô FDU – 1200 EYELA
Dụng cụ
1 Bình cầu cổ nhám 100, 500, 1000 mL 2 Cốc 100, 250, 1000 mL
3 Ống nhỏ giọt
4 Ống mao quản dài 80mm x đkính 1.00mm
5 Ống hút pasteur 3 mL, tiệt trùng từng cái, dài 160mm, tổng dung tích 7,5 mL, chia vạch tới 3 mL,
6 Pipet khắc vạch 0,5 mL, 1 mL, 2 mL, 5 mL 7 Ống đong 10 mL, 25 mL, 250 mL, 1 L 8 Bình cầu đáy trịn 250 mL, 500 mL, MH
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Qui trình tổng hợp ethylenediamine liên kết với acid folic (EDA-FA)
Hình 2.1. Quy trình tổng hợp EDA-FA quy mơ phịng thí nghiệm.
▪ Cách tiến hành:
Bước 1: Hòa tan 0,4414 g acid folic vào 50 mL dung dịch NaOH 0,04 M. Cân đong nguyên liệu
Acid folic Natri hydroxitc Hòa tan Khuấy từ (300 rpm, 10 phút) Khuấy đều Khuấy từ (300 rpm, 60 oC, 12 giờ) Ethylenediamine Acid hydrocloric Tủa Đo pH (pH = 6) Ly tâm 10.000 rpm, 5 phút Rửa tủa Nước cất (3 lần) Sấy khô 65 oC, 6 giờ Sản phẩm EDA-FA
Bước 2: Cho từ từ 120,2 mg ethylene diamine vào dung dịch trên. Khuấy liên tục 12 giờ ở 60 oC bằng máy khuấy từ. Cho từ từ dung dịch HCl 0,2 M đến pH=6.
Bước 3: Sản phẩm được ly tâm 10.000 rpm/5phút. Kết tủa được rửa 3 lần bằng H2O để loại bỏ EDA thừa rồi sấy khô ở 65 oC trong 6 giờ.
▪ Khảo sát và xây dựng quy trình tổng hợp EDA-FA quy mơ 30g/mẻ
Tiến hành khảo sát các thơng số của quy trình tổng hợp:
- Nhiệt độ: nhiệt độ phòng (RT); 60 ℃; 70 ℃; 80 ℃
- Thời gian phản ứng: 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 16 giờ
- Tỉ lệ mol EDA/FA: 1:1; 1,2:1; 1,5:1; 2:1.
Sau khi xây dựng quy trình tổng hợp, tiến hành tổng hợp EDA-FA quy mơ 30 g/mẻ. Sử dụng sản phẩm EDA-FA này làm tác chất cho các nội dung sau.
2.2.2. Tổng hợp Tween 80 liên kết với EDA-FA
Hình 2.2. Quy trình tổng hợp Tween 80-EDA-FA quy mơ phịng thí nghiệm.
▪ Cách tiến hành:
Tween 80, DMF
Hút chân không
Máy hút chân không (60-65 oC, 2 giờ)
Khuấy đều
Máy khuấy từ (300 rpm, 60-65 oC, 6 giờ)
Tủa
Máy đo pH (pH = 7) Cân đong nguyên liệu
EDA-FA Natri hydroxit Hòa tan Máy khuấy từ (300 rpm, 10 phút) Khuấy đều
Máy khuấy từ (300 rpm, 12 giờ) NPC Ly tâm Máy ly tâm (10.000 rpm, 5 phút) Rửa tủa Ethanol (3 lần) Sấy khô Tủ sấy (65 oC, 6 giờ) Sản phẩm Tween 80-EDA- FA Hòa tan
Bước 1: Hòa tan 1,4505 g EDA-FA trong 50 mL dung dịch NaOH 0,06 M thu được dung dịch 1 (dd1).
Bước 2: Hòa tan 1,310 g Tween 80 trong 5 mL DMF, hút chân không trong 2 giờ ở 60-65℃, cho từ từ 0,6045 g NPC vào bình phản ứng, khuấy liên tục trong mơi trường chân không ở 60-65℃ trong 6 giờ.
Bước 3: Cho từ từ dd1 vào bình phản ứng, khuấy liên tục trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng. Sản phẩm được kết tủa trong 10 mL dd HCl 0,1 M. Sản phẩm được ly tâm ở 10000 rpm/5phút. Kết tủa được rửa với EtOH, sấy khô 65℃ trong 6 giờ.
▪ Khảo sát và xây dựng quy trình tổng hợp Tween 80-EDA-FA quy mô 30g/mẻ
Tiến hành khảo sát các thơng số của quy trình tổng hợp:
- Nhiệt độ: nhiệt độ phòng (RT): 60 ℃; 70 ℃; 80 ℃
- Thời gian phản ứng: 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 16 giờ
- Tỉ lệ mol của Tween 80/EDA-FA: 1:1; 1:1,5; 1:2; 1;3.
Sau khi xây dựng được quy trình tổng hợp, tiến hành tổng hợp Tween 80-EDA- FA với quy mô 30 g/mẻ. Đồng thời sử dụng sản phẩm EDA-FA này làm tác chất cho các nội dung sau.
2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng shogaol, fucoidan, apigenin trong các cao dược liệu cao dược liệu
2.2.3.1 . Xác định hàm lượng shogaol trong các cao gừng a/ Định tính shogaol bằng phương pháp TLC a/ Định tính shogaol bằng phương pháp TLC
Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck), dung môi khai triển: ether dầu hỏa - EtOAc (1,5:1). Sau khi khai triển, để khơ bản mỏng ở nhiệt độ phịng. Phun thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH. Sấy bản mỏng ở 110 ℃ đến khi hiện vết, quan sát dưới ánh sáng thường.
b/ Định lượng shogaol bằng phương pháp HPLC
Chuẩn bị mẫu chuẩn: Chất chuẩn 6-shogaol (90%) được cung cấp bởi Sigma-Aldrich, số lơ BCBZ1777. Hịa tan 10 mg 6-shogaol chuẩn trong 10 mL MeOH được dung dịch gốc 1000 ppm. Từ chuẩn gốc, pha chuẩn có nồng độ thực tế là 10 ppm. Lọc qua màng lọc 0,22 µm.
Chuẩn bị mẫu thử: hòa tan 1 mg cao gừng trong 10 mL MeOH. Hút 1 mL pha loãng thành 10 mL với MeOH, đậy nắp, lắc đều thu được dung dịch thử nồng độ 10 ppm. Lọc qua màng 0,22 µm. Mẫu trắng sử dụng là MeOH.
Điều kiện phân tích: cột VDSpher PUR 100 C18 (250 ì 4,6 mm, 5 àm);
oC, detector UV 280 nm; hệ dung môi pha động Acetonitrile - dung dịch 0,1% H3PO4 với chế độ gradient:
Thời gian (phút) Acetonitrile (%) H3PO4 0,1% (%)
3,5 82 18
1 65 35
1,5 60 40
4 80 20
2.2.3.2. Xác định hàm lượng fucoidan trong các cao rong nâu a/ Định tính fucoidan trong rong nâu: không thực hiện. a/ Định tính fucoidan trong rong nâu: khơng thực hiện.
b/ Định lượng fucoidan trong rong nâu bằng phương pháp HPLC Dựa trên cơ sở tham khảo một số tài liệu định lượng fucoidan bằng phương pháp HPLC, chọn được điều kiện như sau: Pha tĩnh cột Shodex, OH pak, KB-804 (kích thước cột 300 × 8 μm), pha động H2O 100%, thể tích tiêm mẫu 20 μL, tốc độ dòng 1 mL/phút, thời gian sắc ký 15 phút, nhiệt độ cột t1 40oC, t2 75oC.
Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 20 mg fucoidan chuẩn (≥ 95%, số lô SLBZ7467) được cung cấp bởi Sigma Aldrich (Singapore) vào bình định mức 10 mL, hịa tan và làm vừa đủ bằng dung môi H2O lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 µm.
Dung dịch thử gốc: Cân chính xác 20 mg mẫu fucoidan vào bình định mức 10 mL, hòa tan và thêm H2O vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 µm.
2.2.3.3. Xác định hàm lượng Apigenin trong các cao cần tây
a/ Định tính apigenin trong cần tây
Phương pháp sắc ký lớp mỏng: Dùng bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck), hệ dung môi khai triển n-hexane - EtOAc (1,5:1). Bột dược liệu (3 g) thêm 15 mL EtOH 96%, đun 45℃ trong 10 phút, lọc và làm khơ dịch cịn khoảng 2 mL được dịch chấm sắc ký. Chuẩn bị dung dịch chuẩn bằng cách hồ tan apigenin chuẩn 99% (Sigma-Aldrich, số lơ BCCC0074) trong MeOH. Triển khai sắc ký, bản mỏng để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm để hiện vết.
b/ Định lượng apigenin trong cao cần tây bằng phương pháp HPLC
Để định lượng apigenin trong cao cần tây, apigenin chuẩn 99% (Sigma- Aldrich, số lô BCCC0074) được cung cấp bởi Sigma Aldrich (Singapore). Sử dụng cột pha đảo VDSpher PUR 100 C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm). Điều kiện sắc ký: pha động Acetonitrile - dung dịch 0,1% CH3COOH (40:60); tốc độ dòng
1,0 mL/phút; bước sóng 335 nm; nhiệt độ cột 25 ℃; thể tích tiêm 20 μL. Tất cả các mẫu được lọc qua màng 0,22 µm trước khi tiêm vào cột HPLC.
2.2.4. Điều chế nano liposome chứa shogaol, fucoidan, apigenin 2.2.5.1. Phương pháp tạo liposome 2.2.5.1. Phương pháp tạo liposome
Hình 2.3. Quy trình tạo màng bao hoạt chất dạng liposome.
▪ Quy trình tổng hợp:
- Cân và hịa tan lecithin, vitamin E vào dung mơi hữu cơ thích hợp.
- Tiến hành cơ quay áp suất giảm ở 45oC trong 4 giờ để loại dung môi hữu cơ. Áp suất chân không được điều chỉnh để loại dung môi bằng cách cho bay hơi từ từ, không quá nhanh tạo màng lipid mỏng và trong suốt bám quanh thành bình.
- Khi đã tạo được màng lipid khơ hồn tồn, hỗn hợp được hydrate hóa với pha nước chứa Tween 80 khuấy 400 vòng/phút ở 60 oC trong 2 giờ đến khi lớp màng lipid mỏng bong ra hết khỏi thành bình và làm lạnh nhanh hệ tiểu phân nano thu được.
2.2.5.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng quá trình tạo hệ nano liposome
2.2.5.2.1. Dung mơi hịa tan lipid
Tổng hợp liposome bằng phương pháp hydrate hóa màng mỏng lipid thường sử dụng dung mơi hữu cơ hịa tan lipid là methanol, chloroform hoặc hỗn hợp chloroform:methanol với tỷ lệ nhất định vì các dung mơi này dễ bay hơi nên thường
Cô quay loại dung mơi hữu cơ 45oC trong 4 giờ
Hịa tan trong dung môi hữu
cơ Lecithin:vitamin E
Cô quay tạo màng lipid Hydrat hóa tạo
liposome Nước cất chứa
Tween 80 Khuấy 400 rpm ở 60oC trong 2
giờ
không để lại dung môi tồn dư trong sản phẩm (ts chloroform = 61,62 oC, ts methanol = 64,7 oC). Do đó nghiên cứu tiến hành khảo sát ba dung mơi hịa tan lipid là: cloroform, methanol và hỗn hợp dung mơi chloroform:methanol (2:1).
2.2.5.2.2. Mơi trường hydrate hóa
Khảo sát ba mơi trường hydrate hóa tạo liposome là: nước cất, đệm pH 5,0 và đệm pH 7,4. Sử dụng lần lượt ba mơi trường hydrate hóa chứa Tween 80 ở nhiệt độ 60oC trong 2 giờ đến khi lớp màng lipid bong hết khỏi thành bình. Kết quả khảo sát được đánh giá dựa vào tính chất hệ phân tán và độ ổn định để lựa chọn môi trường hydrate thích hợp.
2.2.5.2.3. Nhiệt độ hydrate hóa
Khảo sát 5 nhiệt độ hydrate hóa là: nhiệt độ phịng, 50oC, 60oC, 70oC và 80oC. Sử dụng mơi trường hydrate hóa chứa Tween 80 đã được chọn, tiến hành hydrate hóa lần lượt ở 5 nhiệt độ khảo sát trong 2 giờ đến khi lớp màng lipid bong ra hết khỏi thành bình. Kết quả khảo sát được đánh giá dựa vào tính chất hệ phân tán và độ ổn định để lựa chọn nhiệt độ hydrate thích hợp.
2.2.5.2.4. Tỷ lệ lecithin:vitamin E
Bào chế liposome theo phương pháp hydrate hóa màng mỏng với tỷ lệ lecithin:vitamin E (w/w) lần lượt là 9:1, 8:2, 7:3, 6:4 và 5:5. Kết quả khảo sát tỷ lệ lecithin:vitamin E được đánh giá dựa trên cảm quan và độ ổn định ở điều kiện 2 – 8oC sau một tuần bảo quản.
2.2.5.2.5. Khảo sát chất hoạt động bề mặt trong pha nước
Bào chế liposome theo phương pháp hydrate hóa màng mỏng lipid với tỷ lệ lecithin:vitamin E được lựa chọn. Tỷ lệ Tween 80 trong pha nước được khảo sát ở các nồng độ lần lượt là 0,1%, 0,5%, 1,5% và 2,0% (w/v). Kết quả khảo sát dựa trên đánh giá cảm quan và độ ổn định ở điều kiện 2-8oC sau một tuần bảo quản.
2.2.6. Nghiên cứu giảm kích thước tiểu phân
Phương pháp hydrate hóa màng lipid thường tạo ra hạt liposome đa lớp và có kích thước lớn, do đó liposome sau bào chế cần được giảm kích thước hạt bằng
thiết bị đồng nhất mẫu. Nghiên cứu sử dụng phương pháp siêu âm kết hợp phương pháp đồng hóa:
- Siêu âm (thiết bị siêu âm Elma S 80 H): 40 phút.
- Đồng hóa (máy đồng hóa áp suất cao Emulsiglex C5): 800 bar, 10 chu kỳ. 2.2.7. Nang hóa hoạt chất vào hệ liposome
2.2.7.1. Khảo sát lượng tá dược tạo khung
Hệ phân tán liposome sau khi giảm kích thước được đơng khơ với maltodextrin. Khảo sát hàm lượng sử dụng với các tỷ lệ maltodextrin:lipid lần lượt là 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 và 1:5. Lượng tá dược maltodextrin sử dụng được đánh giá dựa trên cảm quan, kích thước trung bình của tiểu phân, chỉ số đa phân tán và thế zeta.
2.2.7.2. Khảo sát tỷ lệ lượng cao chứa dược chất nang hóa vào hệ liposome
Khảo sát tỷ lệ lipid:cao dược chất lần lượt là 1:1, 2:1, 3:1, 4:1. Vì shogaol (cao gừng), apigenin (cao cần tây) và kém tan trong nước nên được phân tán vào pha lipid trong q trình bào chế. Trong khi đó fucoidan (cao rong nâu) tan tốt trong nước nên được phân tán vào pha nước chứa Tween 80. Kết quả khảo sát lượng cao chứa dược chất được nang hóa vào liposome được đánh giá dựa trên cảm quan và độ ổn định ở điều kiện 2-8oC sau một tuần bảo quản.
2.2.7.3. Khảo sát lượng tác nhân hướng đích Tween 80-EDA-FA
Khảo sát tỷ lệ Tween 80-EDA-FA lần lượt là 10%, 15%, 20% tổng khối lượng liposome. Kết quả khảo sát lượng tác nhân hướng đích Tween 80-EDA-FA được đánh giá dựa trên cảm quan và độ ổn định ở điều kiện 2-8oC sau một tuần bảo quản.
2.2.7.4. Khả năng nang hóa hoạt chất
Hiệu suất nang hóa thuốc của liposome được xác định thông qua việc định lượng shogaol (cao gừng), fucoidan (cao rong nâu), apigenin (cao cần tây) được nang hóa vào liposome bằng HPLC. Lượng hoạt chất tự do trong hệ phân tán liposome bị loại đi khi lọc mẫu qua màng MWCO 3500 Dalton. Lượng hoạt chất được nang hóa vào liposome được tính tốn bằng hiệu số giữa lượng hoạt chất toàn phần và lượng hoạt chất tự do theo công thức:
Hiệu suất nang hóa thuốc (%) = Khối lượng thuốc được nang hóa vào liposome 100 Khối lượng thuốc tồn phần
Chương III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Tổng hợp EDA-FA ở quy mơ phịng thí nhiệm 3.1. Tổng hợp EDA-FA ở quy mơ phịng thí nhiệm
3.1.1. Xác định cấu trúc hóa học
Hình 3.1. Phổ FT-IR của FA, EDA, EDA-FA
Phân tích phổ hồng ngoại FT-IR của sản phẩm EDA-FA trong khoảng từ 4000- 400 cm-1, có tín hiệu tại 3415-3265 cm-1 của amine bậc 2 (-N-H-); 1645 cm-1 của C=O (liên kết amide) và 1556 cm-1 là dao động uốn cong của liên kết N-H.
Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của Acid Folic
-NH- C=O -N-H 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 EDA-FA FA cm-1 EDA
Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của EDA-FA
Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của sản phẩm EDA-FA cho thấy, trong cấu trúc EDA-FA có các proton có độ chuyển dịch hóa học điển hình: 1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) 1.90~2.25 (4H, C23, C24), 2.79 ( 2H, C32), 4.19 - 4.47 (7H, C12, N34, C22, C33), 6.63 - 6.65 ( 2H, C15, C19), 6.85 -6.88 (3H, N11, N13), 7.58 - 7.60 (2H, C16, C18), 7.78 (1H, N21), 8.62 (1H, C8). Độ chuyển dịch hóa học của mẫu EDA-FA tổng hợp phù hợp với độ dịch chuyển hóa học của Liu, Li et al. và Trindade, Frade et al [5].
Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của sản phẩm EDA-FA cho thấy, trong cấu trúc EDA-FA có các carbon có độ chuyển dịch hóa học điển hình: 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) 27.99~31.77 (C23, C24), 39.00-41 (C32, C32), 46.1 (C12), 53.87 (C22), 11.24 (C15, C19),122.26 (C17), 128.11 (C16, C18), 147.79 (C8, C9), 150.33 (C14), 154~155 (C4, C2), 164.49 (C20), 175.66 (C25, C28,C6). Độ chuyển dịch hóa học của