Các nghiên cứu nano hóa cao cần tây và apigenin

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu công nghệ điều chế nano apigenin, nano 6 shogaol và nano fucoidan từ các cao dược liệu (Trang 31)

Apigenin là một Flavonoid trong chế độ ăn phổ biến có nhiều trong các loại trái cây, rau, dược liệu và phục vụ nhiều chức năng sinh lý, như chống viêm mạnh, chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng vi-rút và giảm huyết áp. Do đó, Apigenin đã được sử dụng như một loại thuốc truyền thống trong nhiều thế kỷ. Gần đây, Apigenin đã được nghiên cứu rộng rãi cho các tác động chống ung thư và độc tính thấp. Apigenin đã được báo cáo có thể ngăn chặn các bệnh ung thư khác nhau ở người và In Vivo bằng nhiều tác dụng sinh học, như kích hoạt apoptosis tế bào và autophagy, ngăn chặn chu kỳ tế bào, ngăn chặn di chuyển và xâm lấn tế bào, và kích thích phản ứng miễn dịch [61].

Kể từ khi Birt et al. lần đầu tiên báo cáo rằng Apigenin có hoạt động chống ung thư vào năm 1986 [62], ngày càng có nhiều bằng chứng được chứng minh rằng Apigenin có hiệu quả chống ung thư đối với các loại ung thư khác nhau với cả hai dòng tế bào In Vitro và chuột In Vivo.

Apigenin đã được chứng minh có tác dụng chống ung thư rộng ở nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư đại trực tràng, ung thư vú, ung thư gan, ung thư phổi, khối u ác tính, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư xương [63-67]. Flavone này ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư bằng cách kích hoạt quá trình apoptosis của tế bào, gây ra autophagy và điều chỉnh chu kỳ tế bào. Apigenin cũng làm giảm sự vận động của tế bào ung thư và ức chế sự di chuyển và xâm lấn của tế bào ung thư. Gần đây, Apigenin được báo cáo cho thấy các hoạt động chống ung thư bằng cách kích thích phản ứng miễn dịch [68].

Hình 1.13. Cấu trúc phân tử và chức năng sinh lý của Apigenin.

Tất cả các bằng chứng thu thập được cho đến nay chỉ ra rõ ràng rằng Apigenin có các hoạt động chống ung thư mạnh mẽ chống lại các bệnh ung thư khác nhau ở người và kết hợp với các tác nhân hóa trị liệu khác. Điều đáng lưu ý là trong hầu hết các trường hợp , điều trị Apigenin có thể đồng thời gây ra nhiều tác dụng chống ung thư trong cùng một phương pháp điều trị. Ví dụ, trong các tế bào ung thư biểu mô nang (ACC), Apigenin đã ngăn chặn sự sống sót của tế bào ACC-2 bằng cách gây ra cả apoptosis và bắt giữ pha G2 / M theo cách phụ thuộc vào liều và thời gian [64]. Và trong các tế bào ung thư ruột kết HCT116 của con người, điều trị Apigenin đã kích hoạt cả autophagy và apoptosis [69]. Hơn nữa, trong các tế bào u ác tính ở người, Zhao và các đồng nghiệp đã báo cáo rằng Apigenin cho thấy tác dụng chống ung thư hiệu quả khi ngăn chặn sự di chuyển và xâm lấn của tế bào, gây ra sự bất hoạt chu kỳ tế bào ở pha G2/M và đồng thời gây ra apoptosis tế bào [63]. Các hiệu ứng chống ung thư khác nhau được kích hoạt đồng thời bởi Apigenin đã chứng minh rằng Apigenin có một loạt các hiệu ứng chống ung thư.

Năm 2016, Xin Jin, điều chế thành công liposome mang apgenin trên cơ sở

(TPGS). Kết quả nghiên cứu với tế bào ung thư phổi A549 in vitroin vivo cho thấy hiệu lực cao của TPGS.

Năm 2017, Kacoli Banerjee, nghiên cứu nano hóa apigenin bằng liposome và ứng dụng trong điều trị ung thư đại tràng. Các thí nghiệm tiền lâm sàng cho thấy liposome chứa apigenin có khả năng tương thích với hồng cầu (hemocompatibility) và tương thích tế bào (cytocompatibility) với các tế bào thường fibroplast cao. Các xét nghiệm trên mẫu ghép ngoại lai (xenograft) khối u cũng cho thấy liposome chứa apigenin có hoạt lực chống ung thư.

Năm 2019, Kacoli Sen, nghiên cứu chế tạo hệ nano liposome chứa kép apigenin và 5-FU (AFNL). Kết quả cho thấy khi kết hợp 2 loại hoạt chất riêng biệt trên, nano hóa chúng thì sinh khả dụng được tăng lên nhiều lần, đồng thời hoạt lực của chúng sẽ được tăng lên rất đáng kể. Cụ thể với tế bào ung thư trực tràng, liposomes AFNL ức chế tốt hơn sự hình thành mạch máu mới, giảm mạnh hơn sự phát triển của tế bào và làm tăng xu hướng chết tế bào theo chương trình (apoptosis).

Năm 2021, Changwon Yang, nghiên cứu kết hợp apigenin và 5-FU trong điều trị ung thư đại tràng. Kết quả nghiên cứu với tế bào ung thư HCT116 và HT29 cho thấy apigenin không những làm tăng tính tương hợp sinh học của 5-FU mà còn giúp phục hồi tốt p53, ức chế sự biểu hiện bất thường của enzyme TS (Thymidylate synthase ), làm tăng khả năng chết theo chương trình của các tế bào.

Năm 2021, theo Eva F. DeRango-Adem và Jonathan Blay, Apigenin, theo đường uống, có sinh khả dụng hơi thấp chừng 30% và có thể hấp thụ vào mạch tuần hoàn với Cmax sau 0,5-2,5 giờ (Tmax) với T1/2 khoảng 2,52 ± 0.56 giờ. Để tăng sinh khả dụng của Apigenin, nhiều công trình khoa học đã được công bố như muối hóa làm tăng tính tan, (Sánchez-Marzo et al., 2019). Nghiên cứu chế tạo các hệ mang nano mang Apigenin cũng được quan tâm bởi hệ nano sẽ bảo vệ cho Apigenin tránh bị phân hủy trong hệ tiêu hóa, tăng khả năng hấp thụ thông qua hệ thống bạch huyết, phóng thích từ từ và hướng trúng đích (ví dụ khối u) tránh được tác dụng phụ

(Leonarduzzi et al., 2009; Wang et al., 2013). Hoặc tạo các hệ nano micelles (Zhang et al., 2017), (Telange et al., 2017) và (Zhao et al., 2013). Hệ liposome chứa

Apigenin cũng được nghiên cứu và thử nghiệm với tế bào ung thư đại tràng cả in vitroin vivo (Banerjee et al., 2017), (Gao et al., 2019), (Ding et al., 2020; Wang et al., 2020).

Chương II: THỰC NGHIỆM 2.1. Nguồn dược liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1. Nguồn dược liệu: cao gừng, cao rong nâu, cao cần tây

Nguyên liệu đầu vào đã được xác định với các chỉ tiêu sau :

Bảng 2.1. Kết quả đánh giá nguyên liệu cao gừng

Chỉ tiêu Cao gừng (COA) Kết quả

Tính chất Bột màu vàng,

tan trong nước

Bột màu vàng, tan trong nước

Độ ẩm (105 oC) 4,3% 17,30%

Định tính (6-shogaol) Đúng Đúng

Định lượng (6-shogaol) - 2%

Bảng 2.2. Kết quả đánh giá nguyên liệu cao rong nâu

Chỉ tiêu Cao rong nâu

(COA) Kết quả

Tính chất Bột màu nâu Bột màu nâu

Độ ẩm 6,3% 12,22%

Định tính (Fucoidan) Đúng Đúng

Định lượng (Fucoidan nguyên

trạng) 79,10% 78,87%

Tro toàn phần 23,4% 23,5%

Bảng 2.3. Kết quả đánh giá nguyên liệu apigenin

Chỉ tiêu Apigenin (COA) Kết quả

Tính chất Bột màu vàng nâu Bột màu vàng nâu

Độ ẩm 0,21% 4,53%

Định tính Đúng Đúng

Định lượng 51,12% 58,80%

Tro toàn phần 0,80% 0,82%

2.1.2. Nguyên liệu và thiết bị

Bảng 2.4. Nguyên liệu, hóa chất nghiên cứu

STT Tên nguyên liệu – hóa chất Hãng sản xuất

1 Bột gừng (Shogaol) Jl. Alternatif Cibubur, Indonesia, số lô 0000254494 (tháng 4/2020) 2 Bột cần tây (Apigenin) Salus Nutra Inc, China, số lô

191210 (tháng 12/2019) 3 Bột rong nâu (Fucoidan) Công ty cổ phần Fucoidan Việt

Nam, số lô 2018 (tháng 12/2018). 4 Apigenin analytical standard Sigma-Aldrich số lô BCCC0074, hàm lượng 99% apigenin 5 Shogaol analytical standard Sigma-Aldrich, số lô BCBZ1777, hàm lượng 90% shogaol 6 Fucoidan analytical standard Sigma Aldrich, số lô SLBZ7467, hàm lượng ≥ 95% fucoidan

7 Cồn công nghiệp Việt Nam

8 Hexane công nghiệp Việt Nam

9 Methanol công nghiệp Việt Nam

10 Fucose USP Reference Standard Sigma/USP

11 Ethyl acetate, for analysis Fisher

12 Ethanol, 99.8+%, for analysis,

absolute (Fisher) Fisher

13 Chloroform, 99.8+%, for analysis,

stabilized with amylene (Fisher) Fisher 14 Petroleum ether 40-60°C, for

analysis, n-hexane < 2% Fisher

15 Methanol, for analysis Fisher

16 Acetic acid 99,5% Trung quốc

17 Acetone, for analysis, CertiFied

Eur.Ph Fisher

18 Hydrochloric acid, 37%, for

analysis, d=1.18 Fisher

19 Acetonitrile for HPLC Grade Fisher

20 Sulfuric acid, min 95%, for

analysis, d=1.83 Fisher

21 Silica gel Himedia

22 Ethylenediamine ReagentPlus®, ≥

99% Sigma-Aldrich

23 4-Nitrophenyl chloroformate 96% Sigma

24 Dimethylformamide Sigma

26 Lecithin, Refined Fisher

27 Vitamin E – Acetat (96%) Germany

28 Cholesterol (95%) Fisher

29 Hydrochloric acid, 37%, for

analysis, d=1.18 Fisher

30 Acid Folic (97%) Acros

31 Natri hydroxit (99,6%) Sigma

Bảng 2.2. Danh mục trang thiết bị và dụng cụ

STT Thiết bị

1 Hệ thống cô quay chân không Eyela CCA-1111, bộ gia nhiệt OSB- 2100.

2 Máy khuấy từ IKA

3 Cân phân tích DV215CD/OHAUS 4 Bể siêu âm Ultrasonic Cleaner 5 Máy cô quay 20L

6 Hệ thống sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 7 Hệ thiết bị cất thu hồi dung môi

8 Thiết bị UV-Vis 1800, hãng Shimadzu (Nhật Bản) 9 Tủ sấy OF-12G/JEIO TECH

10 Máy quang phổ hồng ngoại (FTIR) 11 Máy khuấy đũa

12 Máy đo pH 13 Mấy sấy phun

14 Máy đo kích thước hạt Nanosizer SZ-100 15 Máy ly tâm HermLe

16 Máy ép đùn Extruder

17 Máy đồng hóa áp suất cao Emulsiflex C5-Avestin 18 Máy khuấy cánh 100 L

19 Hệ thống đông khô FDU – 1200 EYELA

Dụng cụ

1 Bình cầu cổ nhám 100, 500, 1000 mL 2 Cốc 100, 250, 1000 mL

3 Ống nhỏ giọt

4 Ống mao quản dài 80mm x đkính 1.00mm

5 Ống hút pasteur 3 mL, tiệt trùng từng cái, dài 160mm, tổng dung tích 7,5 mL, chia vạch tới 3 mL,

6 Pipet khắc vạch 0,5 mL, 1 mL, 2 mL, 5 mL 7 Ống đong 10 mL, 25 mL, 250 mL, 1 L 8 Bình cầu đáy tròn 250 mL, 500 mL, MH

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Qui trình tổng hợp ethylenediamine liên kết với acid folic (EDA-FA)

Hình 2.1. Quy trình tổng hợp EDA-FA quy mô phòng thí nghiệm. ▪ Cách tiến hành:

Bước 1: Hòa tan 0,4414 g acid folic vào 50 mL dung dịch NaOH 0,04 M. Cân đong nguyên liệu

Acid folic Natri hydroxitc Hòa tan Khuấy từ (300 rpm, 10 phút) Khuấy đều Khuấy từ (300 rpm, 60 oC, 12 giờ) Ethylenediamine Acid hydrocloric Tủa Đo pH (pH = 6) Ly tâm 10.000 rpm, 5 phút Rửa tủa Nước cất (3 lần) Sấy khô 65 oC, 6 giờ Sản phẩm EDA-FA

Bước 2: Cho từ từ 120,2 mg ethylene diamine vào dung dịch trên. Khuấy liên tục 12 giờ ở 60 oC bằng máy khuấy từ. Cho từ từ dung dịch HCl 0,2 M đến pH=6.

Bước 3: Sản phẩm được ly tâm 10.000 rpm/5phút. Kết tủa được rửa 3 lần bằng H2O để loại bỏ EDA thừa rồi sấy khô ở 65 oC trong 6 giờ.

Khảo sát và xây dựng quy trình tổng hợp EDA-FA quy mô 30g/mẻ

Tiến hành khảo sát các thông số của quy trình tổng hợp:

- Nhiệt độ: nhiệt độ phòng (RT); 60 ℃; 70 ℃; 80 ℃

- Thời gian phản ứng: 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 16 giờ

- Tỉ lệ mol EDA/FA: 1:1; 1,2:1; 1,5:1; 2:1.

Sau khi xây dựng quy trình tổng hợp, tiến hành tổng hợp EDA-FA quy mô 30 g/mẻ. Sử dụng sản phẩm EDA-FA này làm tác chất cho các nội dung sau.

2.2.2. Tổng hợp Tween 80 liên kết với EDA-FA

Hình 2.2. Quy trình tổng hợp Tween 80-EDA-FA quy mô phòng thí nghiệm. ▪ Cách tiến hành:

Tween 80, DMF

Hút chân không

Máy hút chân không (60-65 oC, 2 giờ)

Khuấy đều

Máy khuấy từ (300 rpm, 60-65 oC, 6 giờ)

Tủa

Máy đo pH (pH = 7) Cân đong nguyên liệu

EDA-FA Natri hydroxit Hòa tan Máy khuấy từ (300 rpm, 10 phút) Khuấy đều

Máy khuấy từ (300 rpm, 12 giờ) NPC Ly tâm Máy ly tâm (10.000 rpm, 5 phút) Rửa tủa Ethanol (3 lần) Sấy khô Tủ sấy (65 oC, 6 giờ) Sản phẩm Tween 80-EDA- FA Hòa tan

Bước 1: Hòa tan 1,4505 g EDA-FA trong 50 mL dung dịch NaOH 0,06 M thu được dung dịch 1 (dd1).

Bước 2: Hòa tan 1,310 g Tween 80 trong 5 mL DMF, hút chân không trong 2 giờ ở 60-65℃, cho từ từ 0,6045 g NPC vào bình phản ứng, khuấy liên tục trong môi trường chân không ở 60-65℃ trong 6 giờ.

Bước 3: Cho từ từ dd1 vào bình phản ứng, khuấy liên tục trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng. Sản phẩm được kết tủa trong 10 mL dd HCl 0,1 M. Sản phẩm được ly tâm ở 10000 rpm/5phút. Kết tủa được rửa với EtOH, sấy khô 65℃ trong 6 giờ.

Khảo sát và xây dựng quy trình tổng hợp Tween 80-EDA-FA quy mô 30g/mẻ

Tiến hành khảo sát các thông số của quy trình tổng hợp:

- Nhiệt độ: nhiệt độ phòng (RT): 60 ℃; 70 ℃; 80 ℃

- Thời gian phản ứng: 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 16 giờ

- Tỉ lệ mol của Tween 80/EDA-FA: 1:1; 1:1,5; 1:2; 1;3.

Sau khi xây dựng được quy trình tổng hợp, tiến hành tổng hợp Tween 80-EDA- FA với quy mô 30 g/mẻ. Đồng thời sử dụng sản phẩm EDA-FA này làm tác chất cho các nội dung sau.

2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng shogaol, fucoidan, apigenin trong các cao dược liệu cao dược liệu

2.2.3.1. Xác định hàm lượng shogaol trong các cao gừng a/ Định tính shogaol bằng phương pháp TLC a/ Định tính shogaol bằng phương pháp TLC

Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck), dung môi khai triển: ether dầu hỏa - EtOAc (1,5:1). Sau khi khai triển, để khô bản mỏng ở nhiệt độ phòng. Phun thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH. Sấy bản mỏng ở 110 ℃ đến khi hiện vết, quan sát dưới ánh sáng thường.

b/ Định lượng shogaol bằng phương pháp HPLC

Chuẩn bị mẫu chuẩn: Chất chuẩn 6-shogaol (90%) được cung cấp bởi Sigma-Aldrich, số lô BCBZ1777. Hòa tan 10 mg 6-shogaol chuẩn trong 10 mL MeOH được dung dịch gốc 1000 ppm. Từ chuẩn gốc, pha chuẩn có nồng độ thực tế là 10 ppm. Lọc qua màng lọc 0,22 µm.

Chuẩn bị mẫu thử: hòa tan 1 mg cao gừng trong 10 mL MeOH. Hút 1 mL pha loãng thành 10 mL với MeOH, đậy nắp, lắc đều thu được dung dịch thử nồng độ 10 ppm. Lọc qua màng 0,22 µm. Mẫu trắng sử dụng là MeOH.

Điều kiện phân tích: cột VDSpher PUR 100 C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm); tốc độ dòng 1,0 mL/phút; thời gian 10 phút; thể tích bơm 20 µL, nhiệt độ cột 25

oC, detector UV 280 nm; hệ dung môi pha động Acetonitrile - dung dịch 0,1% H3PO4 với chế độ gradient:

Thời gian (phút) Acetonitrile (%) H3PO4 0,1% (%)

3,5 82 18

1 65 35

1,5 60 40

4 80 20

2.2.3.2. Xác định hàm lượng fucoidan trong các cao rong nâu a/ Định tính fucoidan trong rong nâu: không thực hiện. a/ Định tính fucoidan trong rong nâu: không thực hiện.

b/ Định lượng fucoidan trong rong nâu bằng phương pháp HPLC Dựa trên cơ sở tham khảo một số tài liệu định lượng fucoidan bằng phương pháp HPLC, chọn được điều kiện như sau: Pha tĩnh cột Shodex, OH pak, KB-804 (kích thước cột 300 × 8 μm), pha động H2O 100%, thể tích tiêm mẫu 20 μL, tốc độ dòng 1 mL/phút, thời gian sắc ký 15 phút, nhiệt độ cột t1 40oC, t2 75oC.

Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 20 mg fucoidan chuẩn (≥ 95%, số lô SLBZ7467) được cung cấp bởi Sigma Aldrich (Singapore) vào bình định mức 10 mL, hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi H2O lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 µm.

Dung dịch thử gốc: Cân chính xác 20 mg mẫu fucoidan vào bình định mức 10 mL, hòa tan và thêm H2O vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 µm.

2.2.3.3. Xác định hàm lượng Apigenin trong các cao cần tây

a/ Định tính apigenin trong cần tây

Phương pháp sắc ký lớp mỏng: Dùng bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck), hệ dung môi khai triển n-hexane - EtOAc (1,5:1). Bột dược liệu (3 g) thêm 15 mL EtOH 96%, đun 45℃ trong 10 phút, lọc và làm khô dịch còn khoảng 2 mL được dịch chấm sắc ký. Chuẩn bị dung dịch chuẩn bằng cách hoà tan apigenin chuẩn 99% (Sigma-Aldrich, số lô BCCC0074) trong MeOH. Triển khai sắc ký, bản mỏng để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm để hiện vết.

b/ Định lượng apigenin trong cao cần tây bằng phương pháp HPLC Để định lượng apigenin trong cao cần tây, apigenin chuẩn 99% (Sigma- Aldrich, số lô BCCC0074) được cung cấp bởi Sigma Aldrich (Singapore). Sử dụng cột pha đảo VDSpher PUR 100 C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm). Điều kiện sắc ký: pha động Acetonitrile - dung dịch 0,1% CH3COOH (40:60); tốc độ dòng

1,0 mL/phút; bước sóng 335 nm; nhiệt độ cột 25 ℃; thể tích tiêm 20 μL. Tất cả các mẫu được lọc qua màng 0,22 µm trước khi tiêm vào cột HPLC.

2.2.4. Điều chế nano liposome chứa shogaol, fucoidan, apigenin 2.2.5.1. Phương pháp tạo liposome 2.2.5.1. Phương pháp tạo liposome

Hình 2.3. Quy trình tạo màng bao hoạt chất dạng liposome. ▪ Quy trình tổng hợp:

- Cân và hòa tan lecithin, vitamin E vào dung môi hữu cơ thích hợp.

- Tiến hành cô quay áp suất giảm ở 45oC trong 4 giờ để loại dung môi hữu

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu công nghệ điều chế nano apigenin, nano 6 shogaol và nano fucoidan từ các cao dược liệu (Trang 31)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(101 trang)