Chương III : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.2. Tổng hợp Tween80-EDA-FA quy mơ phịng thí nghiệm
3.2.2. Khảo sát và xây dựng quy trình tổng hợp Tween80-EDA-FA
a) Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo tỉ lệ mol
Kết quả thực hiện phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA ở nhiệt độ độ phòng, thời gian phản ứng 12 giờ và tỉ lệ mol Tween 80/EDA-FA thay đổi từ 1:1 đến 1:3 được thể hiện ở Bảng 3.5 và Hình 3.11.
Bảng 3.5. Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo tỉ lệ mol
Tỉ lệ mol Phân tử lượng (g/mol) Số mmol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) 1:1 2803,5 1 2,8035 1,1366 40,54 1:1,5 2803,5 1 2,8035 1,3274 47,35 1:2 2803,5 1 2,8035 1,5204 54,23 1:3 2803,5 1 2,8035 1,8012 64,24
Hình 3.11. Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo tỉ lệ mol
Kết quả thu được từ Bảng 3.53 và Hình 3.44 cho thấy hiệu suất phản ứng tăng khi tỉ lệ mol Tween 80/EDA-FA tăng từ 1:1 (40,54%) đến 1:3 (64,24%). Vì vậy sử dụng tỉ lệ mol Tween 80/EDA-FA (1 : 3) để khảo sát nhiệt độ và thời gian phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA.
b) Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo nhiệt độ
Kết quả thực hiện phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA với tỉ lệ mol Tween 80/EDA-FA (1:3), thời gian phản ứng 12 giờ và nhiệt độ phản ứng thay đổi từ nhiệt độ phòng đến 80 ℃ được thể hiện ở Bảng 3.54 và Hình 3.45.
Bảng 3.6. Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo nhiệt độ Nhiệt độ Nhiệt độ (℃) Phân tử lượng (g/mol) Số mmol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) RT 2803,5 1 2,8035 1,7966 64,08 60 2803,5 1 2,8035 1,8013 64,25 70 2803,5 1 2,8035 1,8089 64,52 80 2803,5 1 2,8035 1,8152 64,75
Hình 3.12. Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo nhiệt độ
Kết quả ở Bảng 3.6 và Hình 3.12 cho thấy hiệu suất của phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng. Hiệu suất của phản ứng tăng từ 64,08% (nhiệt độ phòng) đến 64,75% (80℃). Do hiệu suất của phản ứng tăng không đáng kể nên chúng tơi chọn nhiêt độ phịng để khảo sát thời gian phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA.
c) Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo thời gian phản ứng
Kết quả thực hiện phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA với tỉ lệ mol Tween 80/ EDA-FA (1:3), ở nhiệt độ phòng và thời gian phản ứng thay đổi từ 8 giờ đến 16 giờ được thể hiện ở Bảng 3.7 và Hình 3.13.
Bảng 3.7. Kết quả hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo thời gian phản ứng
Thời gian (giờ) Phân tử lượng (g/mol) Số mmol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) 8 2803,5 1 2,8035 1,6534 58,98 10 2803,5 1 2,8035 1,7168 61,24 12 2803,5 1 2,8035 1,7966 64,08 16 2803,5 1 2,8035 1,8015 64,26
Hình 3.13. Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo thời gian
Kết quả ở Bảng 3.7 và Hình 3.13 cho thấy phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA- FA đạt hiệu suất cao nhất ở 16 giờ (64,26%). Tuy nhiên, khi phản ứng thay đổi từ 12 giờ đến 16 giờ, hiệu suất của phản ứng thay đổi khơng đáng kể. Vì vậy, chúng tơi sử dụng thời gian 12 giờ để thực hiện phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA.
Kết luận: Từ kết quả khảo sát về hiệu suất phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-
FA thay đổi theo nhiệt độ, thời gian phản ứng và tỉ lệ mol Tween 80/EDA-FA. Chúng tơi sử dụng nhiệt độ phịng, thời gian phản ứng 12 giờ, tỉ lệ mol Tween 80/EDA-FA (1 : 3) để thực hiện phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA ở quy mô 30 g/mẻ.
3.2.3. Tổng hợp Tween 80-EDA-FA ở quy mơ 30 g/mẻ
▪ Quy trình tổng hợp Tween 80-EDA-FA
Hình 3.14. Quy trình tổng hợp Tween 80-EDA-FA ở quy mô 30 g/mẻ
Tween 80, DMF
Hút chân không
Máy hút chân không (60-65 oC, 2 giờ)
Khuấy đều
Máy khuấy từ (300 rpm, 60-65 oC, 6 giờ)
Tủa
Máy đo pH (pH = 7) Cân đong nguyên liệu
EDA-FA Natri hydroxit Hòa tan Máy khuấy từ (300 rpm, 10 phút) Khuấy đều
Máy khuấy đũa (300 rpm, 12 giờ) NPC Ly tâm Máy ly tâm (10.000 rpm, 5 phút) Rửa tủa Ethanol (3 lần) Sấy khô Tủ sấy (65 oC, 6 giờ) Sản phẩm Tween 80-EDA- FA Hòa tan
Cách tiến hành:
Bước 1: Hòa tan 29,01 g EDA-FA trong 500 mL dung dịch NaOH 0,06 M, thu được dung dịch 1 (dd1).
Bước 2: Hòa tan 26,2 g Tween 80 trong 150 mL DMF, tiến hành hút chân khơng trong 2 giờ duy trì ở 60-65℃, cho từ từ 12,09 g NPC vào bình phản ứng, khuấy liên tục trong môi trường chân không ở nhiệt độ 60-65℃ trong 6 giờ.
Bước 3: Cho từ từ dd1 vào bình phản ứng, khuấy liên tục trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng. Cho từ từ dung dịch HCl 0,1 M cho đến khi pH=7. Hỗn hợp sản phẩm được ly tâm ở 10000 rpm/5phút. Sản phẩm kết tủa được rửa với ethanol sau đó được sấy khô ở 65℃ trong 6 giờ.
▪ Kết quả tổng hợp Tween 80-EDA-FA quy mô 30 g/mẻ
Bảng 3.8. Kết quả tổng hợp Tween 80-EDA-FA ở quy mô 30 g/mẻ
Lần Phân tử lượng (g/mol) Số mol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) 1 2803,5 20 56,07 35,56 63,42 2 2803,5 20 56,07 34,72 61,92 3 2803,5 20 56,07 35,13 62,65 Trung bình 35,14 62,67 %RSD 1,19
Nhận xét: Kết quả từ Bảng 3.8 cho thấy quy trình tổng hợp Tween 80-EDA-FA
có tính ổn định và lặp lại (%RSD = 1,19 ). Hiệu suất tổng hợp trung bình đạt được 62,67%.
3.3. NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ NANO VỚI CÁC CAO DƯỢC LIỆU
3.3.1. Tổng hợp hệ nano liposome quy mơ phịng thí nghiệm
a) Kết quả khảo sát tỷ lệ các thành phần cấu thành liposome
Công thức bào chế cơ bản của hệ nano liposome được thiết lập như sau: tỷ lệ lecithin:vitamin E là 9:1, dung dịch hydrate hóa là nước cất chứa Tween 80 (0,5%; w/v). Công thức đơng khơ có kết hợp thêm tá dược maltodextrin tỷ lệ maltodextrin:lipid là 4:1.
b) Kết quả khảo sát dung mơi hịa tan lipid
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát dung mơi hịa tan lipid
Dung môi Độ tan (mg/mL)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
MeOH 22,50 26,60 24,23 24,44 ± 2,06
CHCl3 222,45 224,20 220,00 222,22 ± 2,11 CHCl3:MeOH 122,76 125,30 124,46 124,17 ± 1,29
Nhận xét: Kết quả khảo sát dung mơi hịa tan lipid cho thấy lecithin:vitamin E
tan trong cả ba dung môi, tan tốt trong CHCl3 và ít tan trong MeOH. Độ tan của lecithin:cholesterol trong hệ CHCl3:MeOH tuy thấp hơn CHCl3 nhưng giảm được lượng CHCl3 sử dụng vì vậy chọn CHCl3:MeOH (2:1, v/v) làm dung mơi hịa tan lipid.
c) Kết quả khảo sát mơi trường hydrate hóa
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát mơi trường hydrate hóa màng lipid
Chỉ tiêu Đệm pH 5,0 Nước cất Đệm pH 7,4
Cảm quan sau bào chế Trong
Độ ổn định sau một tuần Lắng cặn Ổn định
Nhận xét: Nước cất và đệm pH 7,4 cho hệ nano liposome có cảm quan và độ ổn
định tốt nhất. Môi trường đệm pH 5,0 cho cảm quan tốt nhưng không ổn định bằng nước cất sau một tuần bảo quản. Mặc khác nước cất khơng độc, an tồn, dễ bay hơi, rẻ tiền, do đó nghiên cứu chọn nước cất làm mơi trường hydrate hóa lớp màng lipid để tiếp tục khảo sát các thành phần tiếp theo.
d) Kết quả khảo sát nhiệt độ hydrate hóa
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát nhiệt độ hydrate hóa
Chỉ tiêu Rt (30oC) 40oC 50oC 60oC 70oC 80oC Cảm quan sau bào chế Đục Đục Hơi đục Trong Hơi đục Hơi đục Độ ổn định sau một tuần Lắng cặn Ổn định
Nhận xét: Kết quả cho thấy liposome ở nhiệt độ 60oC cho cảm quan và độ ổn định tốt nhất trong các nhiệt độ hydrate hóa khảo sát. Nghiên cứu lựa chọn 60oC làm nhiệt độ hydrate hóa lớp màng lipid.
e) Kết quả khảo sát tỷ lệ lecithin:vitamin E
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát tỷ lệ lecithin:vitamin E
Lecithin:vitamin E 9:1 8:2 7:3 6:4 5:5
Cảm quan sau bào chế Trong Hơi đục Đục
Độ ổn định sau 1 tuần Ổn định Lắng cặn
Nhận xét: Tỷ lệ lecithin:vitamin E là 9:1 (w/w) cho hệ phân tán liposome có cảm
quan và độ ổn định ở điều kiện 2 − 8 oC sau một tuần bảo quản. Kết luận: Chọn tỷ lệ lecithin:vitamin E là 9:1 (w/w) để tiếp tục khảo sát tỷ lệ Tween 80 được bổ sung và pha nước trong q trình hydrate hóa lớp màng lipid.
f) Kết quả khảo sát tỷ lệ chất hoạt động bề mặt trong pha nước
Khảo sát nồng độ Tween 80 trong pha nước bằng cách hydrate hóa màng mỏng lipid với lecithin:vitamin E. Mơi trường hydrate hóa sử dụng Tween 80 trong pha nước ở các nồng độ lần lượt là 0,1%; 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0% (w/v).
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát tỷ lệ Tween 80
Tween 80 trong môi
trường hydrate (%) 0,1 0,5 1,0 1,5 2,0
Cảm quan sau bào chế Hơi đục Trong
Độ ổn định sau 1 tuần Lắng cặn Ổn định Lắng cặn
Nhận xét: Với tỷ lệ là 0,5%, hệ nano liposome cho cảm quan hệ tiểu phân nano
sau bào chế trong và ổn định ở điều kiện 2 – 8 ℃ sau một tuần bảo quản. Ở tỷ lệ Tween 80 là 0,1%; hệ phân tán sau bào chế cho cảm quan hệ tiểu phân nano hơi đục và không ổn định. Tỷ lệ Tween80 trên 0,5% mặc dù cho cảm quan hệ tiểu phân sau bào chế trong nhưng bị sa lắng sau một tuần bảo quản. Kết luận: Chọn nồng độ Tween 80 trong mơi trường hydrate hóa là 0,5% để hydrate hóa lớp màng lipid.
Hình 3.15. Quy trình tổng hợp hệ nano liposome quy mơ phịng thí nghiệm.
▪ Mơ tả quy trình:
Cơ quay áp suất loại dung mơi hữu cơ 45oC trong 4 giờ
Hịa tan trong CHCl3:MeOH (2:1,
v/v) Lecithin:vitamin E
Cô quay tạo màng lipid
Hydrat hóa tạo liposome
Siêu âm
Đồng hóa Nước cất chứa
Tween 80
Khuấy 400 rpm ở 60oC trong 2 giờ
Thời gian: 30 phút Tần số: 37 kHz Số chu kỳ: 10 Áp suất: 800 bar Khuấy 400 rpm, 10 phút Bảo quản ở 2-8 oC
- Cân chính xác 540 mg lecithin; 60 mg vitamin E cho vào bình cầu 100 mL; hịa tan các thành phần vào 5 mL dung môi CHCl3:MeOH (2:1, v/v).
- Khuấy 400 vòng/ phút trong 10 phút cho hỗn hợp đồng nhất.
- Tiến hành cô quay ở nhiệt độ 45 oC trong 4 giờ, áp suất chân không được điều chỉnh để loại dung môi bằng cách cho dung môi bay hơi từ từ, không quá nhanh tạo màng lipid mỏng và trong suốt bám xung quanh thành bình.
- Khi đã tạo được màng lipid khơ hồn tồn, hỗn hợp được hydrat hóa với 10 mL nước cất chứa 50 mg Tween 80 ở nhiệt độ 60 oC trong 2 giờ cho đến khi lớp màng lipid mỏng bong ra hết khỏi thành bình.
- Hệ phân tán liposome được làm giảm kích thước hạt bằng phương pháp siêu âm trong 30 phút và đồng hóa 10 chu kỳ dưới áp suất 800 bar.
- Hệ phân tán liposome sau khi đồng hóa được bảo quản ở nhiệt độ 2-8 oC.
g) Kết quả xác định cấu trúc và kích thước hạt của hệ nano liposome.
Kết quả TEM
Hình 3.16. kết quả TEM của hệ nano liposome
Nhận Xét: Kết quả chụp TEM cho thấy hình dạng, kích thước các hạt
liposome thơng qua kính điện tử truyền qua TEM to hơn so với kích thước được đo bằng phương pháp DLS do mẫu bị tụ do thời gian vận chuyển không được bảo quản với nhiệt độ phù hợp. Ta qua ảnh chụp TEM có thể quan sát thấy rõ các hạt có dạng hình cầu và đường đường kính trung bình thể hiện trong ảnh TEM là 239± 6,4 nm.
Hình 3.16. kết quả đo DLS nano liposome
3.3.2. Tổng hợp hệ nano liposome chứa cao gừng với hoạt chất shogaol quy mơ phịng thí nghiệm
a) Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược tạo khung
Maltodextrin được sử dụng để hỗ trợ làm khô cho hệ liposome. Tiến hành làm khô hệ liposome đã phân tán sử dụng maltodextrin. Thực hiện khảo sát tỷ lệ tá dược tạo khung với lipid lần lượt là 1:4; 1:3; 1:2; 1:1; 2:1.
Bảng 3.14. Tỷ lệ tá dược tạo khung và lipid
Maltodextrin:lipid 2:1 1:1 1:2 1:3 1:4
Cảm quan sau bào chế Khô Không khô
Độ ổn định sau 1 tuần Khô Ẩm
Nhận xét: Liposome được không khô ở tỷ lệ maltodextrin:lipid là 1:1, 1:2, 1:3
là 2:1 cho bánh đông khô đẹp. Nghiên cứu chọn tỷ lệ maltodextrin:lipid là 2:1 để làm tá dược tạo khung và hỗ trợ làm khô.
b) Kết quả khảo sát tỷ lệ cao gừng và hệ liposome
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát tỷ lệ liposome : cao gừng
Hình 3.17. Kết quả DLS hệ nano liposome chứa cao gừng tỉ lệ liposome:cao
gừng 4:1. Công thức Tỉ lệ Liposome:cao gừng Kích thước tiểu phân trung bình (nm) PDI Thế Zeta (mV) CT1 6:1 83,7 0,758 -17,9 CT2 5:1 84,5 0,782 -20,0 CT3 4:1 113,4 0,28 -20,8 CT4 3:1 284,7 0,3 -18,6
Nhận xét: Kết quả DLS cho thấy tỉ lệ liposome:cao gừng là 4:1 cho kích thước
hạt là 117.4 nm với PDI 0,290 và thế Zeta -20,8 mV phù hợp với điều kiện sử dụng như một chất mang thuốc kháng ung thư với kích thước nano.
Kết luận: Nghiên cứu sử dụng tỷ lệ hệ liposome:cao gừng là 4:1 để bào chế hệ
nano liposome chứa cao gừng.
Quy trình tổng hợp hệ nano liposome chứa cao gừng quy mơ phịng thí nghiệm
Hình 3.17. Quy trình tổng hợp nano liposome chứa cao gừng quy mơ phịng thí
nghiệm.
Cô quay áp suất loại dung môi hữu cơ 45oC trong 4 giờ
Hòa tan trong CHCl3:MeOH
(2:1, v/v) Lecithin:vitamin E
Cơ quay tạo màng lipid
Hydrat hóa tạo liposome Siêu âm Đồng hóa Đơng khơ Nước cất chứa Tween 80 Maltodextrin Cao gừng Khuấy 400 rpm ở 60oC trong 2 giờ Thời gian 30 phút Tần số 37 kHz Số chu kỳ: 10 Áp suất 800 bar Khuấy 400 rpm trong 10 phút Bảo quản 2- 8 oC
Loại thuốc tự do Ly tâm (5000 rpm, 15 phút, 25 oC)
▪ Mô tả quy trình:
- Cân chính xác 540 mg lecithin; 60 mg vitamin E và 150 mg cao gừng cho vào bình cầu 100 mL; hòa tan các thành phần vào 5 mL dung môi CHCl3:MeOH (2:1, v/v).
- Khuấy 400 vòng/ phút trong 10 phút cho hỗn hợp đồng nhất.
- Tiến hành cô quay ở nhiệt độ 45 oC trong 4 giờ, áp suất chân không được điều chỉnh để loại dung môi bằng cách cho dung môi bay hơi từ từ, không quá nhanh tạo màng lipid mỏng và trong suốt bám xung quanh thành bình.
- Khi đã tạo được màng lipid khơ hồn tồn, hỗn hợp được hydrat hóa với 10 mL nước cất chứa 50 mg Tween 80 ở nhiệt độ 60 oC trong 2 giờ cho đến khi lớp màng lipid mỏng bong ra hết khỏi thành bình.
- Hệ phân tán liposome được làm giảm kích thước hạt bằng phương pháp siêu âm trong 30 phút và đồng hóa 10 chu kỳ dưới áp suất 800 bar.
- Hệ phân tán liposome tiếp tục được ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút trong thời gian 15 phút ở 25 °C. Shogaol tự do sẽ bị loại ra khỏi hệ chất mang và kết tủa dưới đáy.
- Cân chính xác 1,2 g maltodextrin hịa tan trong 10 mL nước cất và bổ sung vào hệ liposome.
- Sản phẩm được đông khô trong máy đông khô EYELA FDU-1200.
- Sản phẩm được bảo quản ở nhiệt độ 2-8 oC.
▪ Kết quả đánh giá khả năng nang hóa thuốc của liposome
Hiệu suất nang hóa thuốc của liposome được xác định thông qua việc định lượng thuốc tự do bằng HPLC. Kết quả định lượng thuốc tự do được trình bảy trong Bảng
3.16.
Bảng 3.16. Khối lượng shogaol toàn phần và khối lượng shogaol tự do Lần đo Khối lượng shogaol tồn phần (µg) Lần đo Khối lượng shogaol tồn phần (µg)
1 37481
2 36859
3 37721
Trung bình 37354
Lần đo Khối lượng shogaol tự do (µg)
1 2137
2 2259
3 2247
Trung bình 2214
Kết quả định lượng shogaol tồn phần là 37,35 mg và shogaol khơng được nang hóa vào liposome là 2,21 mg. Lượng shogaol được nang hóa vào liposome, hiệu suất nang hóa thuốc của liposome như sau:
- Hiệu suất nang hóa thuốc = 35,14
37,35 × 100 = 94,07 (%)
Kết luận: Kết quả cho thấy khả năng mang thuốc và hiệu suất nang hóa thuốc
của hệ liposome khá cao đạt 94,07%.
3.3.3. Tổng hợp hệ nano liposome chứa cao rong nâu với hoạt chất fucoidan quy mơ phịng thí nghiệm