Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (°C) Thời gian Chu kỳ
1 Duỗi mạch 95 5 phút 1 2 Duỗi mạch 95 40 giây 40 Gắn mồi 52 40 giây Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
Sản phẩm PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trong thạch
agarose1% có bổ sung 1% thuốc nhuộm RedSafe.
3.5.4.4. Điện di sản phẩm trên gel biến tính
Bước 1: Chuẩn bị gel 1%
Chuẩn bị dung dịch agarose 1% trong TBE buffer 1X, bằng cách cân 0,15g bột agarose cho vào 15ml dung dịch TBE 1X. Đun nóng dung dịch Agarose 1% tan trong 2 phút. Để nguội dung dịch tới khoảng 45-50°C. Bổ sung thêm 1,5µl dung dịch thuốc nhuộm RedSafe, lắc đều hỗn dịch. Đổ gel vào khuôn đã được cắm lược trước, đổ theo chiều nằm ngang-phẳng, để yên cho tới khi gel đông lại thì tháo lược ra (khoảng 30 phút là gel đông). Đổ dung dịch điện di TBE 0.5X vào trong bể điện di có chứa gel agarose vừa đổ sao cho ngập bản gel.
Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2 µl loading dye vào 8 µl sản phẩm RT-PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA thường sử dụng từ 4-6 µl DNA marker.
Bước 3: điện di: Nguồn điện trong điện di sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian điện di trong 30 phút.
Bước 4: Lấy gel ra cho vào máy UV-Transiluminator. Chụp kết quả lại bằng máy ảnh chuyên dụng.
Mẫu được coi là dương tính khi sản phẩm chạy điện di xuất hiện băng DNA trùng với độ dài cặp mồi sử dụng để kiểm tra. Ngược lại, mẫu âm tính khi sản phẩm chạy điện di không xuất hiện băng DNA hoặc có băng DNA nhưng không trùng với độ dài cặp mồi sử dụng kiểm tra. Băng DNA được đối chiếu vớikích thước thang chuẩn (maker).
3.5.5. Phương pháp chuẩn độ hiệu giá virus (TCID50/ml)
Chủng virus PED phân lập được xác định hiệu giá virus bằng phương pháp làm TCID50 như sau:
Chuẩn bị tế bào sạch ra đĩa 96 giếng với nồng độ tế bào 2.105 tế bào/ giếng
trước 24h, độ che phủ đáy giếng khoảng 90-100% tiến hành làm chuẩn độ
Pha loãng virus theo cơ số 10 (10-1, 10-2, 10-3….., 10-10) với môi trường DMEM bổ sung (10µg/ml trypsin, 0,3% tryptophotphat broth, 0,03% yeast extract), thể tích cho vào mỗi giếng là 100µl. Mỗi độ pha loãng lặp lại trên 8 giếng, sơ đồ bố trí thí nghiệm như bảng 3.4.