Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.5. Phương pháp chuẩn độ hiệu giá virus (TCID50/ml)
Chủng virus PED phân lập được xác định hiệu giá virus bằng phương pháp làm TCID50 như sau:
Chuẩn bị tế bào sạch ra đĩa 96 giếng với nồng độ tế bào 2.105 tế bào/ giếng
trước 24h, độ che phủ đáy giếng khoảng 90-100% tiến hành làm chuẩn độ
Pha loãng virus theo cơ số 10 (10-1, 10-2, 10-3….., 10-10) với môi trường DMEM bổ sung (10µg/ml trypsin, 0,3% tryptophotphat broth, 0,03% yeast extract), thể tích cho vào mỗi giếng là 100µl. Mỗi độ pha loãng lặp lại trên 8 giếng, sơ đồ bố trí thí nghiệm như bảng 3.4.
Bảng 3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chuẩn độ hiệu giá virus PED
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 CC CC
Hút bỏ hết môi trường nuôi cấy cũ trong từng giếng, rửa thảm tế bào trong mỗi giếng bằng dung dịch PBS (-) với thể tích 200µl/giếng. Rửa 2 lần để loại bỏ triệt để môi trường nuôi, sau đó bổ sung vào mỗi giếng 100 µl virus pha loãng ở
tiến triển bệnh tích tế bào sau 24h, 48h. Sau 72h gây nhiễm, đọc các giếng có bệnh tích tế bào (CPE) tính hiệu giá virus theo công thức Spearman Kaber
Log TCID50 = (Xo + d/2) - d × (∑ri/n)
Trong đó:
Xo là log của bậc pha loãng virus cao nhất d: là log của bậc pha loãng
ri: là số giếng tế bào âm tính ở mỗi bậc pha loãng
n: là số giếng tế bào được gây nhiễm ở mỗi bậc pha loãng
3.5.6. Phương pháp kiểm tra độc lực
Huyễn dịch virus được pha loãng ở 3 nồng độ tương ứng là 104, 103 và 102
TCID50/ml trong môi trường DMEM. Mỗi nồng độ gây nhiễm theo đường uống
cho 2 lợn con khỏe mạnh dưới 7 ngày tuổi (lấy từ những đàn chưa từng xảy ra bệnh PED), mỗi con 2ml.Đồng thời sử dụng 3 lợn làm đối chứng cho uống 5ml môi trường DMEM. Đánh dấu và nhốt lợn riêng theo các ô chuồng khác nhau tương ứng với từng nồng độ và theo dõi hiện tượng tiêu chảy ở từng cá thể trong 7 ngày. Trong thời gian theo dõi, lợn thí nghiệm được chăm sóc nuôi dưỡng bình thường. Những lợn bị tiêu chảy,mẫu phân được lấy vàkiểm tra nhanh bằng kít phát hiện kháng nguyên PEDV. Lợn chết trong thời gian theo dõi tiến hành mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể. Sau 7 ngày theo dõi, mổ khám toàn bộ lợn thí nghiệm còn sống và lợn đối chứng quan sát bệnh tích đại thể. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như bảng 3.5.
Bảng 3. 5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra độc lực các chủng PEDV phân lập
Liều thử nghiệm (TCID50/ml) Liều uống (ml) PEDV/TN8/2016 PEDV/HY3 /2015 Nhóm Số lợn (con) Nhóm Sốlợn (con) 104 2ml 1 2 5 2 103 2ml 2 2 6 2 102 2ml 3 2 7 2 ĐC âm 2ml 4 3 4 3 ĐC: đối chứng
3.5.7. Phương pháp chẩn đoán nhanh PEDV bằng PED-Ag test kit
Nguyên lý: Bộ kít này dựa trên nguyên lý kỹ thuật sắc ký miễn dịch sử
dụng phương pháp Direct Sandwich.
Hai kháng thể (KT) đơn dòng trong thiết bị kết hợp đặc thù với các khu quyết định kháng nguyên khác nhau của kháng nguyên cần chẩn đoán. Sau khi cho bệnh phẩm thấm vào vị trí đệm cellulose của thiết bị, các kháng nguyên của virus PED sẽ di chuyển và kết hợp với hợp chất thể keo màu vàng chứa kháng thể đơn dòng kháng virus PED, để tạo thành phức chất ‘KT-KN’. Sau đó, phức hợp này kết hợp với kháng thể đơn dòng kháng virus PED khác trong màng nitơ- cellulose của thiết bị, để tạo thành phức chất kẹp hoàn chỉnh ‘KT-KN-KT’ (“Ab- Ag-Ab” direct sandwich].
Tất cả các thành phần có trong test bao gồm - Dung dịch pha loãng.
- Tăm bông.
- Dụng cụ thử cho kết quả.
Được lấy ra và để ở nơi bằng phẳng, sạch sẽ, thoáng mát.
Chuẩn bị mẫu
Lấy mẫu phân (để thăm dò sự hiện diện của virus PED) được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất của bộ kit PED-Ag test kit. (Hình 3.1A)
Thực hiện theo các bước
1. Sử dụng que tăm bông trong test kit để lấy mẫu phân tại trực tràng của lợn. 2. Cho que tăm bông vào lọ mẫu có chứa 1ml dung dịch pha loãng (được cung cấp trong bộ test kit).
3. Khuấy xoay tròn que tăm bông trong dung dịch pha loãng đến khi phân tan hết (khoảng 10 giây).
4. Lấy dụng cụ xét nghiệm trong túi bạc, đặt ở nơi bằng phẳng và khô ráo. 5. Sử dụng ống nhỏ giọt có sẵn, rút lấy dung dịch trong lọ mẫu đã được hòa lẫn với phân ở trên.
6. Nhỏ 4-5 giọt dung dịch trong lọ mẫu đã hòa lẫn vào lỗ tròn trên dụng cụ thử nghiệm.
7. Phản ứng xảy ra khi có đường màu tím chạy dọc trên bảng kết quả (nằm ở giữa dụng cụ xét nghiệm) ngay cạnh lỗ tròn chứa dung dịch bệnh phẩm.
Sau 1 phút nếu không thấy có sự di chuyển của màu tím, nhỏ thêm 1 giọt dung dịch bệnh phẩm.
8. Đọc kết quả 5-10 phút.
Đọc kết quả
-Ở phía bên trái trong giếng kết quả, một thanh màu xuất hiện (tại chữ C),
có nghĩa là các bước thực hiện phản ứng đúng cách. Kết quả dương tính khi có thêm 1 thanh màu xuất hiện bên phải (tại chữ T) trong giếng kết quả (Hình 3.1B)
-Ở phía bên trái trong giếng kết quả, không có xuất hiện thanh màu nào, có
nghĩa thao tác thực hiện không đúng, không thực hiện đúng hướng dẫn đã quy định. Do đó, phản ứng phải được thực hiện lại.
A: Thao tác thực hiện B: Đọc kết quả
Hình 3. 1. Kỹ thuật kiểm tra PEDV bằng kít test nhanh
Nguồn: Nguyễn Thanh Phong (2015)
3.5.8. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của virus
Để xác định đường cong sinh trưởng của chủng virus PED trên tế bào Vero, tiến hành gây nhiễm virus lên 9 chai T25 nuôi tế bàoVero một lớp đã được chuẩn
bị trước 24 giờ. Với cùng một liều (MOI = 0,01), 1 chai làm đối chứng không gây nhiễm virus. Các bước được tiến hành như sau:
+ Loại bỏ môi trường nuôi cấy trong tất cả các chai tế bào T25cm2
+ Rửa thảm tế bào trong chai nuôi bằng 5ml dung dịch PBS (-) 1X/chai, rửa 2 lần nhằm loại bỏ tế bào chết và môi trường cũ.
+ Gây nhiễm virus lên tế bào Vero 1ml/T25, ủ ở 37oC trong 60 phút.
+ Loại bỏ huyễn dịch virus, rửa 02 lần bằng PBS (-) 1x, 5ml/chai
+ Bổ sung môi trường duy trì (DMEM có bổ sung tryptose phosphate broth 0,5%, yeast extract 0,05% và 10µg/ml trypsin).
+ Thu hoạch chai gây nhiễm virus ở các thời điểm 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ sau gây nhiễm virus. Tại mỗi thời điểm thu 2 chai gây nhiễm chuyển vào tủ -80oC. Sau khi thu hết các chai gây nhiễm ở các thời điểm, tiến hành chuẩn độ virus đã thu để định lượng virustheo phương pháp Spearman Kaber.
+ Đường cong sinh trưởng được xây dựng có biến là log10 của TCID50 tại
mỗi thời điểm thu virus.
3.5.9. Phương pháp giải trình tự gen
Cặp mồi đặc hiệu dùng giải trình tự gen mã hóa spike protein của PEDV
(gen S) được thực hiện theo công bố của Gao et al. (2013). Trình tự mồi được
trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Trình tự mồi sử dụng giải trình tự gen S
Tên mồi Trình tự (5’ – 3’) nucleotide Vị trí Kích thước (bp)
W20F GTTACCTGATGGCATTATGTTT 19837 2382 W20R AACGAGATTGGCACTACTAAGAC 22218 W21F TTCAGGTTTCTGGACCATAGC 21933 1068 W21R CTCATACTAAAGTTGGTGGGAAT 23000 W22F TAGGGAGTTGCCTGGTTTC 22812 1039 W22R CAGTCGGGAATAAATGTCATCAATA 23850 W23F GTTTGAACACTGTGGCTCATG 23708 1637 W23R TTCGCAACAGATGTAGGTCAG 25344
Chu trình nhiệt của các phản ứng RT-PCR khuếch đại gen S được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Chu trình nhiệt của phản ứng RT - PCR nhân gen S
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (°C) Thời gian
1 Duỗi mạch 95 5 phút 2 Duỗi mạch 95 40 giây Gắn mồi 55 40 giây Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 10 phút
Sản phẩm PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trong thạch agarose1%, có bổ sung 1% RedSafe Nucleic Acid Staining Solution (20,000x). Sản phẩm PCR đặc hiệu được gửi đến Công ty Macrogen Hàn Quốc để giải trình tự gen 2 chiều bằng cặp mồi tương ứng.
3.5.10. Phương pháp xây dựng cây sinh học phân tử
Trình tự gen S của PEDV bao gồm 4161 nucleotode (nt) mã hóa cho 1386 axit amin (aa) được bắt cặp so sánh với các trình tự tương ứng của PEDV đã công bố trên Genbank (phụ lục 3). Sau đó sử dụng phần mềm BioEdit (phiên bản 7.2.6.1) để sắp xếp- căn chỉnh trình tự nucleotide của các chủng PEDV. So sánh trình tự nucleotide và trình tự acid amin suy diễn của các chủng virus PED ở Việt Nam với trình tự công bố trên ngân hàng gen quốc tế, sẽ phân tích được sự biến đổi di truyền, nguồn gốc tiến hóa của chúng. Sau đó dùng phần mềm xây dựng
cây sinh học phân tử MEGA 7 (Kumar et al., 2016).
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ THU THẬP MẪU BỆNH PHẨM DƯƠNG TÍNH VỚI PEDV TRÊN LỢN PEDV TRÊN LỢN
Trong tổng số 22 mẫu lưu thuộc hai tỉnh Hưng Yên và Thái Nguyên có 16 mẫu phân và 6 mẫu ruột cho kết quả dương tính với virus PED bằng kỹ thuật RT –PCR. Kết quả kiểm tra được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công ty TNHH MTV Avac Việt Nam (bảng 4.1 và hình 4.1). Những mẫu này sẽ được nghiền và đồng nhất thành huyễn dịch lọc qua màng lọc vô trùng 0,45µm để phân lập virus.
Bảng 4.1. Danh sách mẫu bệnh phẩm dương tính với PEDV thuộc hai tỉnh Hưng Yên và Thái Nguyên
TT Tên mẫu Năm thu thập Địa điểm Loại mẫu RT -PCR Kết quả
1 PEDV/HY1/2015 2015 Văn Giang- Hưng Yên Phân Dương tính 2 PEDV/HY2/2015 2015 Văn Giang- Hưng Yên Phân Dương tính 3 PEDV/HY3/2015 2015 Ân Thi- Hưng Yên Phân Dương tính 4 PEDV/HY4/2015 2015 Ân Thi- Hưng Yên Ruột Dương tính 5 PEDV/HY5/2015 2015 Tiên Lữ- Hưng Yên Ruột Dương tính 6 PEDV/HY6/2015 2015 Tiên Lữ- Hưng Yên Phân Dương tính 7 PEDV/TN1/2015 2015 Phổ Yên – Thái Nguyên Ruột Dương tính 8 PEDV/TN2/2015 2015 Phổ Yên – Thái Nguyên Phân Dương tính 9 PEDV/TN3/2015 2015 Phổ Yên – Thái Nguyên Phân Dương tính 10 PEDV/TN4/2015 2015 Phổ Yên – Thái Nguyên Ruột Dương tính 11 PEDV/TN5/2016 2016 Đồng Hỷ - Thái Nguyên Phân Dương tính 12 PEDV/TN6/2016 2016 Đồng Hỷ - Thái Nguyên Phân Dương tính 13 PEDV/TN7/2016 2016 Phổ Yên - Thái Nguyên Phân Dương tính 14 PEDV/TN8/2016 2016 Phổ Yên - Thái Nguyên Ruột Dương tính 15 PEDV/HY7/2016 2016 Văn Lâm – Hưng Yên Phân Dương tính 16 PEDV/HY8/2016 2016 Văn Lâm – Hưng Yên Phân Dương tính 17 PEDV/HY9/2016 2017 Khoái Châu – Hưng Yên Phân Dương tính 18 PEDV/HY10/2017 2017 Khoái Châu – Hưng Yên Phân Dương tính 19 PEDV/HY11/2017 2017 Ân Thi – Hưng Yên Phân Dương tính 20 PEDV/HY12/2017 2017 Ân Thi – Hưng Yên Phân Dương tính 21 PEDV/TN9/2017 2017 Phổ Yên – Thái Nguyên Ruột Dương tính 22 PEDV/TN10/2017 2017 Phổ Yên – Thái Nguyên Phân Dương tính
Hình 4.1. Kết quả chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR
M: Maker 100bp; (-): ĐC âm; 1: ĐC dương; 2-10: các mẫu virus PED năm 2015; 11-17: mẫu virus PED năm 2016; 18-22: mẫu virus PED năm 2017.
4.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VIRUS TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM TRÊN
TẾ BÀO VERO
4.2.1. Kết quả phân lập PEDV
Nghiên cứu phân lập virus PED được thực hiện trên tế bàoVero trong môi trường DMEM có bổ sung 10µg trypsin như mô tả phần phương pháp nghiên cứu. Kết quả đã phân lập thành công 2 chủng PEDV (tỷ lệ thành công 9,0%) (Phụ lục 1 và Bảng 4.2). Tuy nhiên, bệnh tích gây ra bởi virus PED trên tế bào Vero chỉ được phát hiện ở đời cấy chuyển thứ 2 đối với chủng PEDV/TN8/2016 và đời cấy chuyển thứ 3 đối với chủng PEDV/HY3/2015. Kết quả nghiên cứu này,phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đây của Hofmann and Wyler (1988) tác giả đã quan sát được CPE ngay ở lần cấy truyền đầu tiên trên cùng một tế bào và hiệu ứng bệnh tích đặc trưng rõ ở đời cấy chuyển thứ 5 (Hofmann and Wyler, 1988). Trong khi đó, một nghiên cứu khác đã có kết quả báo cáo cho thấy CPE đặc trưng được phát hiện ở lần cấy truyền thứ 2 và trở nên rõ ràng hơn với các
lần cấy truyền tiếp theo trên tế bào Vero (Kusanagi et al., 1992). Ngoài ra, nỗ lực
phân lập virus PED từ các mẫu bệnh phẩm khác đều không thành công. Sự không thành công với các mẫu bệnh phẩm khác có thể do sự thích nghi của virus PED lên tế bào Vero phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: độ tươi của mẫu, nồng độ virus trong mẫu, thành phần các chất chứa trong ruột non.
Bảng 4.2. Kết quả phân lập PEDV trên tế bào Vero Tỉnh Năm thu Tỉnh Năm thu thập mẫu Số lượng mẫu Kết quả phân lập
Số mẫu dương tính Số mẫu âm tính
Hưng Yên 2015 6 1 5 2016 3 0 3 2017 3 0 3 Thái Nguyên 2015 4 0 4 2016 4 1 3 2017 2 0 2 Tổng 22 2 20
Đặc biệt trong quá trình nghiên cứu phân lập virus PED, tôi nhận thấy một số yếu tố làm ảnh hưởng tới tỷ lệ (%) phân lập thành công PEDV như: quan sát thấy độc tính trên tế bào Vero của một số mẫu ruột và phân. Xuất hiện hiện tượng co hoặc teo nhỏ tế bào sau khi gây nhiễm và ủ 1 giờ, các tế bào này tiếp tục nuôi cấy sau 24 giờ gây nhiễm bị bong và chết, không thể làm giá thể cho virus xâm nhập vào và nhân lên, bệnh tích tế bào không xuất hiện.Nguyên nhân ban đầu có thể do thành phần các chất chứa có trong mẫu bệnh phẩmcó tính axit hoặc kiềm tác động lên màng tế bào, làm tổn thương màng tế bào gây chết tế bào hoặc làm mất thụ thể trên màng tế bào để virus có thể bám vào. Một yếu tố khác cũng ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng phân lập virus thành công chính là mật độ thảm tế bào Vero một lớp ban đầu sử dụng cho cấy truyền mù PEDV. Mật độ thảm tế bào ban đầu nên ở 90-100% che phủ đáy chai nuôi, do trong môi trường phân lập có bổ sung trypsin, một loại enzyme dùng để bóc tách các tế bào rời nhau. Khi mật độ tế bào ít (các tế bào non đang trong giai đoạn phát triển cầu nối giữa các tế bào còn lỏng lẻo dễ dàng bị cắt đứt bởi trypsin) dưới tác động của trypsin các tế bào co lại bong khỏi đáy chai trôi nổi trong môi trường làm cho PEDV mất khả năng nhân lên trong tế bào dẫn tới giảm tỷ lệ (%) phân lập thành công PEDV. Mặt khác nồng độ trypsin bổ sung trong môi trường phân lập hêt sức quan trọng quyết định đến sự thành bại của nghiên cứu. Khi nồng độ trypsin trong môi trường từ 15-20µg/ml các tế bào bị tách rời bong khỏi đáy chai. Tuy nhiên, nếu nồng độ trypsin nhỏ hơn 15µg/ml trong môi trường, các tế bào ổn
định không bị tách rời và có thể quan sát được bệnh tích. Điều này phù hợp với
nghiên cứu của María Elena Trujillo-Ortega1 et al. (2016).
Vấn đề sử dụng kỹ thuật RT – PCR để xác định sự có mặt của virus trong dịch nuôi cấy bằng cách khuếch đại một đoạn gen của PEDV cũng đã được báo
cáo ở một số nghiên cứu trước. Trước đó, Kim et al. (2001) đã sử dụng kỹ thuật
RT – PCR khuếch đại một đoạn gen S xác định sự có mặt của PEDV trong dịch
nuôi cấy. Trong khi đó tác giả Li et al. (2012) khuếch đại gen M để xác định sự
có mặt của PEDV trong môi trường nuôi cấy. Ở nghiên cứu này, kỹ thuật RT –
PCR được sử dụng để khuếch đại 1 đoạn gen S có kích thước 651 bp của Kim et
al. (2001) nhằm xác nhận sự có mặt của PEDV trong dịch nuôi cấy cho kết quả
dương tính với virus này. Điều này chứng minh quá trình phân lập virus PED trên tế bào Vero đã thành công (hình 4.2A1 và 4.2B1).
PED/TN8/2016 PED/HY3/2015 Đối chứng tế bào
A1 B1 C1 B A C M (+) TN8(-) M (+) TN8 (-) (-) M (+) HY3 A1 (-) M (+) HY3 B1
Hình 4. 2. Biểu hiện bệnh tích tế bào của 2 chủng PEDV phân lập được và kết quả giám định bằng kỹ thuật RT –PCR